[发明专利]一种改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法

说明书

本发明公开了一种改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法，该改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法具体步骤如下：S1：通过1‑2个循环的血细胞分离机（单采机）可以处理5000mL的外周血，获得10^9‑10^10数量级的PBMCs，取分离好的PBMCs过30um尼龙网目去除悬浮细胞中的细胞团，S2：标记非CD4+细胞，S3：LD分离柱阴选除去non CD4+细胞，S4：抗体标记CD25+细胞，S5：MS柱阳选CD25+细胞。本发明通过1‑2个循环的血细胞分离机（单采机）可以处理5000mL的外周血，获得10^9‑10^10数量级的PBMCs，轻松得到传统采血办法100倍以上的单个核细胞，并且由于其他血成分直接回输，避免浪费，对患者总血成分、血细胞计数影响更轻微。

技术领域

本发明涉及Treg细胞分离技术领域，具体为一种改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法。

背景技术

CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)是一种具有免 疫调节功能的细胞群，可通过抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制传统T细 胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌等，在维持机体内环境的稳定、 诱导移植物的耐受中发挥重要作用，是机体内以主动方式获得和维持自身耐受的一种重要方式。

Treg能分泌IL-10、TGF-B.表达Foxp3及CTLA-4分子 等，通过细胞间直接接触或细胞因子间接方式抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制传统T细胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌等，在维持机体内环境的稳定、抑制过度自身免疫反应、诱导移植物的耐受中发挥重要作用，是机体内以主动方式获得和维持自身耐受的一种重要方式，并与免疫调节、自身免疫性疾病、肿瘤免疫、 移植免疫耐受、母胎免疫耐受等诸多方面有着密切的联系。因此，Treg细胞是目前国内外研究的热点。

现有技术采用直接抽血的方法，如需最终达到治疗剂量，每次采血量要求在200mL以上，（其中的PBMC部分最熟练的操作人员、应用质量最好的PBMC分选试剂也仅能达到10^8个数量级），即使这样也有高达1/3的患者采血后无法最终获得足够的治疗剂量的细胞导致后续治疗计划流产。而多次、大量采血最终需要的只是其中全血中的白细胞中的单个核细胞中的一小部分细胞成分，其他血成分都被浪费，同样也达不到单次输注百万级（10^6个）Treg细胞的治疗剂量需求。

当前，国内外已有不少前期基础研究及临床试验表明，自体Treg分离、扩增、回输技术有望成为治疗自身免疫性疾病如1型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、风湿性疾病、移植后免疫耐受等临床上很多棘手疾病状况的有效手段，相比糖皮质激素、免疫抑制剂及其他调节免疫功能的生物制剂，其在安全性、低副作用、有效性方面都有长足优势。然而，自体Treg细胞在外周血比例较少（这在患者中表现更突出）、分离效率低、扩增困难，最终导致细胞的低得率的成为限制Treg细胞免疫治疗方法的主要瓶颈。本方案即旨在解决Treg细胞分离得率低的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法，该改良的高效的人自体Treg细胞分离扩增方法具体步骤如下：

S1：通过1-2个循环的血细胞分离机（单采机）可以处理5000mL的外周血，获得10^9-10^10数量级的PBMCs，取分离好的PBMCs过30um尼龙网目去除悬浮细胞中的细胞团，300g离心10分钟，弃干上清液去除死细胞；

S2：标记非CD4+细胞：

1）用90ul MACS buffer重悬（每107细胞）后，加入10ul Biotin labeled Cocktail抗体，混匀，4℃孵育10min，

2）加入20ul anti-Biotin microbeads，4℃孵育15min，

3）加入1mL MACS buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清，