[发明专利]一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法

摘要

本发明涉及一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法。该方法包括野生千层塔孢子体表面灭菌、制备外植体、外植体适应性培养、外植体内生菌灭菌、丛生苗诱导增殖培养、丛生苗生长培养等操作步骤。本发明无菌外植体丛生苗诱导增殖成功率在90％以上，丛生苗平均繁殖系数可以达到60以上，培养获得的无菌丛生苗可以直接用于制备无菌外植体，进行丛生苗的循环诱导增殖。本发明不仅提高了千层塔丛生苗的诱导增殖成功率和丛生苗繁殖系数，而且一次灭菌处理就可获得大量无菌外植体，无需重复灭菌操作，降低染菌风险，提高工作效率，简化工艺流程，适用于千层塔的规模化生产。

主权项

1.一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)野生千层塔孢子体表面灭菌。选取株高10～15cm的健壮野生千层塔孢子体，在流水中用软毛刷蘸取洗洁精对枝叶和根部进行清洗，冲洗干净表面残留的洗洁精后在超净工作台中依次用75％乙醇溶液浸泡0.5～1.0min、0.1％升汞溶液浸泡5～10min、2％次氯酸钠溶液浸泡15～20min，对孢子体进行表面灭菌处理，最后用无菌水冲洗3～5次，用无菌纸吸干表面水分。(2)制备外植体。在无菌条件下切取孢子体靠近根部、长度为2～3cm、带有6～10片叶子的茎段作为外植体，外植体上部切口为平切口，下部切口为45°角斜切口。(3)外植体适应性培养。将外植体在改良MS培养基中适应性培养2～3周，选取没有染菌、绿色有光泽、叶茎无损伤白斑的外植体，即为表面无菌外植体。其中，改良MS培养基配方为：1/4MS矿质元素+1/2MS有机元素+25g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.8～6.0；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1000～1500Lx，光照时间12～14h。(4)外植体内生菌灭菌。将表面无菌外植体在无菌条件下转接入内生菌灭菌培养基中培养4～5周，选取没有染菌、茎叶有光泽、水分充盈的外植体，即为无菌外植体。其中，内生菌灭菌培养基配方为：改良MS培养基+0.3mg/L孔雀石绿+40mg/L青霉素+50mg/L链霉素+100μg/L两性霉素B；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1500～2000Lx，光照时间12～14h。(5)丛生苗诱导增殖培养。将无菌外植体在无菌条件下转接入丛生苗诱导增殖培养基中进行丛生苗诱导增殖，培养5～6个月后，有90％以上无菌外植体能够成功诱导丛生苗，每个无菌外植体可产生60～70个丛生苗。其中，丛生苗诱导增殖培养基配方为：改良MS培养基+50～150mg/LL‑丝氨酸+0.2～0.5mg/L6‑BA；培养条件为：温度25±2℃，光照采用白炽灯光+单色蓝光，总光强度为2000～2500Lx(其中，白炽灯光强度1000～1500Lx，波长450～480nm蓝光强度500～1000Lx)，光照时间14～16h。(6)丛生苗生长培养。将诱导的丛生苗在无菌条件下整丛转接入丛生苗生长培养基中培养5～6个月，获得无菌丛生苗，无菌丛生苗高度5～15cm，部分丛下部长有长度0.1～0.5cm的发状根。其中，丛生苗生长培养基为：改良MS培养基+0.1～0.5mg/LNAA；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1500～2000Lx，光照时间12～14h。(7)循环诱导增殖。将培养获得的无菌丛生苗分离为单株，其中一部分单株按照步骤(2)的方法制备无菌外植体，继续步骤(5)、(6)、(7)的操作，进行丛生苗的循环诱导增殖，另一部分单株进行诱导生根培养，长成完整的千层塔无菌植株。