[发明专利]一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法

摘要

本发明公开了一种表达红曲霉菌Mn‑SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法，属于生物工程领域。本发明通过筛选并设计出红色红曲霉Mn‑SOD简并引物，利用PCR技术扩增红曲霉Mn‑SOD基因的全长序列，经EcoR I和HindIII酶切后连接至相同酶切的表达载体pET21a及pET28a，并分别转化至E.coli BL21，均实现合成酶基因在E.coli中的表达，得到具有酶活力和耐酸性的Mn‑SOD。本发明将红曲霉Mn‑SOD歧化酶基因导入到原核生物中实现表达，为红曲霉Mn‑SOD歧化酶的大规模生产、分离提供了可能，且本发明构建的工程菌分泌的MnSOD来源于红色红曲霉，在pH3.8条件下处理1h仍具有80%的活性，具有耐酸性，可用于耐酸性超氧化物歧化酶的生产菌株。

主权项

1.一种表达红曲霉菌Mn‑SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法，其特征在于：该构建方法将红曲霉Mn‑SOD歧化酶基因导入到大肠杆菌中实现表达，具体包括如下步骤：（1）查找NCBI数据库，进行Block对比、引物分析，筛选并设计出红曲霉菌基因组Mn‑SOD的简并引物,所述简并引物序列分别见SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2；（2）从红曲霉菌获得Mn‑SOD酶基因的全长cDNA，然后在简并引物的引导下PCR扩增红曲霉菌，得到部分Mn‑SOD基因；（3）通过红曲霉菌Mn‑SOD基因组设计扩增引物，扩增得到完整红曲霉菌Mn‑SOD基因组；用PCR方法扩增Mn‑SOD基因组，经EcoRI和Hind III酶切点酶切后重组至相同酶切的表达质粒pET21a上，构建成pET21a‑SOD；用相同的方法构建pET28a‑MnSOD；所述扩增引物序列分别见SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4；（4）将步骤（3）构建的重组质粒pET21a‑SOD、pET28a‑MnSOD表达载体分别导入大肠杆菌BL21细胞，并在IPTG诱导下表达得到有活性的Mn‑SOD，采用邻苯三酚自氧化法测定Mn‑SOD活性。