[发明专利]一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法

说明书

本发明公开了一种表达红曲霉菌Mn‑SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法，属于生物工程领域。本发明通过筛选并设计出红色红曲霉Mn‑SOD简并引物，利用PCR技术扩增红曲霉Mn‑SOD基因的全长序列，经EcoR I和HindIII酶切后连接至相同酶切的表达载体pET21a及pET28a，并分别转化至E.coli BL21，均实现合成酶基因在E.coli中的表达，得到具有酶活力和耐酸性的Mn‑SOD。本发明将红曲霉Mn‑SOD歧化酶基因导入到原核生物中实现表达，为红曲霉Mn‑SOD歧化酶的大规模生产、分离提供了可能，且本发明构建的工程菌分泌的MnSOD来源于红色红曲霉，在pH3.8条件下处理1h仍具有80%的活性，具有耐酸性，可用于耐酸性超氧化物歧化酶的生产菌株。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说涉及一种表达红色红曲霉菌（Monascus rubberCCTCC NO:M2013082）锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的工程大肠杆菌构建、表达方法。

背景技术

超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase，即SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化细胞体内的超氧阴离子自由基生成水和过氧化氢，消除超氧阴离子对细胞的危害。根据其结合金属离子的种类不同，超氧化物歧化酶分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种。Mn-SOD是由氨基酸残基构成的四面体，结构简单，主要存在于真核细胞的线粒体中。线粒体是真核生物细胞进行有氧呼吸的主要场所，线粒体内过量产生超氧阴离子对线粒体乃致整个细胞造成伤害。因此，具有超氧阴离子自由基清除作用的Mn-SOD，是消除细胞线粒体内超氧阴离子、维持细胞的正常生长代谢的关键酶，对维持机体氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。目前已广泛地应用于医药、食品、化妆品等领域。

红曲最早发现于中国，已有一千多年的生产应用历史，明代李时珍在《本草纲目》评价：“此乃人窥造化之巧者也”，“奇药也”。红曲霉菌是我国重要的微生物资源，在其生长代谢过程中能够产生多种具有生物活性的代谢产物，如具有超氧阴离子自由基清除作用的Mn-SOD。由于红曲菌产桔霉素问题的存在，国内外对红曲的安全性提出了怀疑。相关研究发现红曲霉中Mn-SOD序列可能与桔霉素的产生密切相关，在橙色红曲菌中得到了可能与桔霉素产毒相关的EST序列。经生物信息学分析，发现其中一个基因P5编码的蛋白与Mn-SOD高度同源（涂追. 橙色红曲菌(AS3.4384)SOD基因的克隆与功能分析[D]. 南昌大学, 2007.）。因此，研究红曲霉Mn-SOD序列及其表达对研究调控红曲霉桔霉素的产生具有重要意义。

Mn-SOD是一种具有广阔前景的蛋白多肽类药物。在SOD家族中，Mn-SOD与其他SOD相比具有寿命长、分子量小、抗炎和抗辐射作用等优点，而且锰的毒性较铜、铁低。并且，红曲霉菌来源的Mn-SOD在酸性条件下具有一定的耐酸性。目前，尽管很多学者已从许多生物体克隆到了Mn-SOD 基因，并且部分基因已经在原核或真核生物体内进行了表达，但国内对大肠杆菌表达Mn-SOD 尤其是红曲霉来源Mn-SOD的研究还鲜见报道。因此，积极开展Mn-SOD基因工程技术有重大的研究意义。

发明内容

鉴于现有技术的上述不足，本发明的目的是一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建、表达方法，包括以下步骤：

（1）查找NCBI数据库，进行Block对比，利用primer premier 5.0进行引物分析，筛选并设计出红曲霉菌（MonascusrubberCCTCC NO. M2013082）基因组Mn-SOD简并引物，简并引物序列分别见SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。