[发明专利]一种非转基因CRISPR突变体的制备方法

摘要

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas9技术的非转基因突变体的制备方法，具体的，包括构建方法和筛选方法。构建方法为将CRISPR‑Cas9及sgRNA预组装，定位在农杆菌的T‑DNA，通过农杆菌侵染目标植物及共培养，CRISPR‑Cas9及sgRNA的序列不需要整合到目标植物基因组里，就可实现目标植物的目的基因定点改变，使得到的目的基因定点改变的突变体材料，不需要经过有性生殖和后代分离群体筛选等过程，也不含有任何外源基因序列。本发明提供的高通量测序与高分辨率熔解曲线技术对得到的再生苗进行筛选，能够在转基因当代高效、快速地从再生苗中鉴定得到目的基因发生突变的突变体植株，即使是对突变体比例为混合群体1/100的低比例突变体筛选，本发明的筛选方法仍可保证优异的准确性和灵敏度。

主权项

1.一种非转基因CRISPR‑Cas9突变体植株制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1：将含有1个内含子的Cas9基因连入CRISPR基础载体，得到具有内含子的CRISPR‑Cas9载体；S2：根据目的基因，设计sgRNA靶定序列，并进一步连入启动子序列，合成具有启动子的sgRNA序列；S3：将S2所得的具有启动子的sgRNA序列连入S1所得的具有内含子的CRISPR‑Cas9载体，得到预组装Cas9突变载体；S4：将S3得到的预组装Cas9突变载体转化农杆菌，将带有预组装Cas9突变载体的农杆菌侵染目标植物外植体，共培养；S5：将S4共培养后的外植体转移至适合再生且不添加抗生素的培养基上，在适用于目标植物的、农杆菌介导的遗传转化条件下，诱导目标植物愈伤和芽再生，得到若干株独立株系的再生苗；S6：将S5得到再生苗随机分成若干待测组，分别将各待测组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA，采用目的基因sgRNA靶定区域的特异性引物PCR扩增包含以sgRNA靶定位点为中心上下游共80‑120bp的区域，得到各待测组PCR产物样本；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA，并PCR扩增相同区域，得到野生组PCR产物样本；使用野生组PCR产物样本对各待测组PCR产物样本进行稀释，得到各待测组对应的稀释组PCR产物样本；S7：分别高通量测序S6得到的各待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和各稀释组PCR产物样本，使用BWA软件默认参数将测序所得序列定位至PCR扩增区域的野生型序列上；分别统计待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本每个位点处与野生型序列相同的核苷酸的比例，得到非变异核苷酸频率，变异核苷酸总频率则为1‑非变异核苷酸频率；比较每个位点在待测组PCR产物样本、其对应稀释组PCR产物样本和野生组PCR产物样本中的变异核苷酸总频率；若某一位点变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则表明该位点存在突变，若某一待测组PCR产物样本存在突变位点，则表明该待测组含有目的基因发生突变的突变体植株，则该待测组为突变组；S8：分别将S7筛选得到的突变组进一步分成若干待测亚组，分别将各待测亚组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA；对待测亚组与野生组使用同样的sgRNA靶定位点附近区域特异性引物在同样条件下进行高分辨率熔解曲线PCR，若待测亚组所得曲线与野生组明显分离，则为该待测亚组为突变亚组，所述明显分离为待测亚组所得曲线与野生组曲线在差异最大处的值统计检验P<0.001；每组突变亚组的每个独立再生小苗分别与野生型小苗取等量叶片组织1:1混合，提取DNA，进行高分辨率熔解曲线PCR；若所得曲线与野生组有明显分离，则该独立再生小苗为目的基因发生突变的突变体植株；S9：取S8筛选得到的突变体植株的叶片组织，提取DNA，使用任意两对或两对以上定位于T‑DNA插入片段的引物进行PCR扩增，以避免出现假阴性结果；并同时使用S3中预组装的PDS‑Cas9突变载体DNA作为阳性对照。若阳性对照可扩增得到PCR产物，而突变体DNA两对或两对以上引物均无法得到扩增产物，则表明该突变体植株中很可能不含有外源基因序列，将该植株作为非转基因突变体候选植株；S10：将S9得到的非转基因突变体候选植株取样进行无性繁殖，对无性繁殖植株进行CRISPR‑Cas9载体T‑DNA区抗性基因的抗性筛选，若植株不具有抗性，则表明不含有外源基因序列，为非转基因CRISPR‑Cas9突变体植株；S11：将S10鉴定得到的非转基因CRISPR‑Cas9突变体植株转移至适宜的生根培养基，继续培养，得到非转基因CRISPR‑Cas9突变体完整植株。