[发明专利]一种非转基因CRISPR突变体的制备方法

说明书

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas9技术的非转基因突变体的制备方法，具体的，包括构建方法和筛选方法。构建方法为将CRISPR‑Cas9及sgRNA预组装，定位在农杆菌的T‑DNA，通过农杆菌侵染目标植物及共培养，CRISPR‑Cas9及sgRNA的序列不需要整合到目标植物基因组里，就可实现目标植物的目的基因定点改变，使得到的目的基因定点改变的突变体材料，不需要经过有性生殖和后代分离群体筛选等过程，也不含有任何外源基因序列。本发明提供的高通量测序与高分辨率熔解曲线技术对得到的再生苗进行筛选，能够在转基因当代高效、快速地从再生苗中鉴定得到目的基因发生突变的突变体植株，即使是对突变体比例为混合群体1/100的低比例突变体筛选，本发明的筛选方法仍可保证优异的准确性和灵敏度。

技术领域

本发明属于现代分子育种技术领域，涉及在不导入外源基因的前提下利用基因编辑技术构建及筛选作物突变体，具体为一种非转基因CRISPR突变体的制备方法。

背景技术

转基因技术为作物改良提供了强大的工具。然而，公众对转基因作物中的外源基因及其表达可能引起的食品安全和基因漂移问题存在担忧，制约了转基因技术的应用。近年来，CRISPR-Cas9技术介导的基因组编辑迅猛发展，其精准和高效性使以其为基础的定点突变在作物改良方面具有巨大的应用潜力，甚至有望替代传统的转基因技术。

目前植物中最广泛应用的CRISPR-Cas9技术依赖于Cas9核酸内切酶和sgRNA基因稳定整合到目标植物基因组中。对于单年生有性繁殖目标植物，稳定整合的外源基因(包括Cas9和sgRNA基因等)能够通过有性生殖和后代分离群体筛选实现与目标突变的分离，从而从基因组中清除出去，得到非转基因的突变子代。然而，有性生殖及后代群体筛选清除外源基因的方法不适用于通过无性繁殖的多年生植物。因为这些植物大多具有较长的童期，需要多年生长之后才能进行有性生殖；更重要的是，其基因组大多高度杂合，有性生殖将导致子代中重要优异性状的分离。因此，在依赖于无性繁殖的多年生杂交作物中，需要直接构建非转基因的CRISPR-Cas9突变体。

已有研究表明，进入原生质体的预组装的CRISPR-Cas9核糖核蛋白能够引起目的基因突变，不需要CRISPR-Cas9基因稳定整合至目标植物基因组中。目前，通过基因枪的方法已成功将CRISPR-Cas9核糖核蛋白导入小麦和玉米细胞中，产生非转基因的突变体。然而，原生质体和基因枪的方法仅适用于少部分作物，很多作物无法通过原生质体实现整株植株的再生。

大多数作物能够利用叶片、下胚轴、子叶、愈伤等外植体实现再生，通过农杆菌与外植体共培养已能够在很多多年生作物的细胞中实现农杆菌T-DNA基因的瞬时表达和蛋白合成。但是，将Cas9基因定位于农杆菌T-DNA区，能否成功在作物细胞中瞬时表达，并实现CRISPR-Cas9蛋白对目标作物基因的定点突变尚未见报道。

另一方面，CRISPR-Cas9技术对目标作物基因的定点突变是由目标植物在修复Cas9剪切DNA位点时随机自动发生的，可以在目标区段内引起不同类型的基因突变，可能是删除少数几个核苷酸，也有可能导致增加少数核苷酸或是替换原有的核苷酸，不同独立株系的突变植株的情况不同。而大多数的基因突变在小苗期无法直观确定其表型变化，即无法通过表型判断是否为突变体植株。且由于希望得到的是外源基因没有整合到基因组上的植株，这类植株通常对抗生素没有抗性，无法使用抗生素进行筛选，导致获得的再生苗中既包含突变体植株，也包含没有发生突变的野生型植株。因此需要采用特定的方法进行筛选鉴别，从较大样本中将突变体植株筛选出来。

发明内容

本发明提供一种基于CRISPR-Cas9技术的非转基因突变体的构建和筛选方法，使得到的目的基因定点改变的突变体材料，不需要经过有性生殖和后代分离群体筛选等过程，也不含有任何外源基因序列。

一种非转基因CRISPR-Cas9突变体植株制备方法，所述制备方法包括以下步骤：