[发明专利]一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法

摘要

本发明公开了一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法，其中甘蓝型油菜遗传转化方法包括以下步骤：(1)无菌外植体的培养；(2)目的载体的制备；(3)农杆菌转化液的制备；(4)农杆菌与下胚轴共培养；(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织；(6)诱导愈伤组织再分化形成芽；(7)转基因阳性筛选；(8)生根培养；(9)小苗炼苗移栽。本发明通过对遗传转化方法的整体流程设置、关键步骤的参数条件等进行改进及进一步优选，与现有技术相比利用有效的筛选手段能够高效、快速获取甘蓝型油菜转基因苗，本发明将DsRed基因插入到含有目的基因的载体中，得到带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株，通过观察下胚轴的颜色能够快速高效的进行转基因阳性筛选。

主权项

1.一种甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)无菌外植体的培养：将甘蓝型油菜种子灭菌后，播种到种子萌发培养基，暗培养6～7天；(2)目的载体的制备：将DsRed基因插入到含有目的基因的载体中，将获取的带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株中，‑80℃保存；(3)农杆菌转化液的制备：在无菌条件下，将所述步骤(2)得到的农杆菌菌株接种到含有相应抗性的LB中，28℃、180～220rpm的条件下培养12～13h；待其OD600达到0.4～2.1，吸取菌液至无菌的离心管中，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；接着，加入浸染液悬浮，6000rpm的条件下3min离心后，弃上清；再次加入浸染液悬浮，使最终得到的菌液其OD600满足0.4～0.6，4℃保存以备用；(4)农杆菌与下胚轴共培养：向灭过菌的平皿中加入侵染液，然后向其中加入所述步骤(1)中萌发出的下胚轴，接着再向其中加入所述步骤(3)所得到的菌液使该菌液稀释至10倍体积，进行浸染，然后将所述外植体表面的水分去除后将该外植体转移到共培养培养基中，暗培养36～48小时；(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：将所述步骤(4)得到的所述外植体转移到愈伤诱导培养基中，进行培养，诱导外植体脱分化形成愈伤组织；(6)诱导愈伤组织再分化形成芽：在无菌的条件下，将所述步骤(5)所获得的愈伤组织转入芽诱导培养基中，进行培养，诱导愈伤组织形成芽，每2～3周继代一次；(7)转基因阳性筛选：待愈伤组织或芽形成后，于黑暗处，利用绿色激发光透过红色滤光片观察下胚轴的颜色，若带有红光，则说明目的基因已整合到基因组中，为转基因阳性；若无红光，则反之，为转基因阴性；(8)生根培养：在无菌条件下，将所述步骤(6)获得的带有完整生长点的芽剪切下来，并转移到生根培养基上进行生根培养；(9)小苗炼苗移栽：将所述步骤(8)中获得的已生根的小苗进行炼苗，然后进行移栽。