[发明专利]一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法

说明书

本发明公开了一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法，其中甘蓝型油菜遗传转化方法包括以下步骤：(1)无菌外植体的培养；(2)目的载体的制备；(3)农杆菌转化液的制备；(4)农杆菌与下胚轴共培养；(5)诱导外植体脱分化形成愈伤组织；(6)诱导愈伤组织再分化形成芽；(7)转基因阳性筛选；(8)生根培养；(9)小苗炼苗移栽。本发明通过对遗传转化方法的整体流程设置、关键步骤的参数条件等进行改进及进一步优选，与现有技术相比利用有效的筛选手段能够高效、快速获取甘蓝型油菜转基因苗，本发明将DsRed基因插入到含有目的基因的载体中，得到带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株，通过观察下胚轴的颜色能够快速高效的进行转基因阳性筛选。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，更具体地，涉及一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法，该方法通过植物组织培养技术能够快速繁殖并高效获取转基因油菜。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napus，AACC，2n＝38)，是一种适应性强、用途广、经济价值高、发展潜力大的油料作物之一。我国是世界油菜生产大国，占世界油菜播种面积的26％左右，油菜籽总产量占世界油菜籽总产量的28％左右。长江流域冬油菜区是我国油菜主产区，占全国油菜面积的85％左右。近几年油菜的产量与质量已达到国际领先水平。尽管如此，优化和改良油菜的品质，一直以来都作为农业生物技术的一个重要目标。

甘蓝型油菜属于十字花科芸薹属，是一种越年生或一年生草本植物。根据禹氏三角关系，由白菜(Brassica rapa,AA,n＝10)和甘蓝(Brassica oleracea,CC,n＝9)进化而来，与埃塞比俄亚芥(Brassica carinata,BBCC,n＝17)和芥菜型油菜(Brassica juncea,AABB,n＝18)具有同源关系，故是一种典型的异源四倍体品种。由于单个基因拷贝数较多，在甘蓝型油菜中利用传统的杂交育种方法不能够满足科学家们对甘蓝型油菜生理、生化机制的探索。所以，基因工程为培育优良品种提供了新的方法，遗传转化法能突破物种间的界限，为创造更适合人类生活需要的新品种开辟了广阔的前景。转基因技术在油菜育种上已经被广泛应用，一些具有很高实用价值的基因已被转入油菜中，并得到表达，使油菜品质改良进入了一个新的阶段。

快速、高效获得转基因再生株系是有效基因功能验证的前提。目前，子叶、下胚轴、小孢子等都可以作为甘蓝型油菜遗传转化再生体系的载体，其转化效率与再生效率主要受其基因型、品种的限制。另外，褐化以及玻璃化也在一定程度上影响其再生效率。CN201611152235专利提出了一种利用甘露醇，作为油菜小孢子培养的渗透调节剂的方法；CN201310172910专利解决了甘蓝型油菜再生过程中去除玻璃化的难题；CN201610714886专利为一种芥菜型油菜提供了快速培育再生苗的组织培养方法。这些方法均无法解决高效、快速获取转基因苗。而甘蓝型油菜的遗传转化再生体系对于基因功能分析、遗传育种等方面都具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜高效遗传转化及快速鉴定方法，其中通过对遗传转化方法的整体流程设置、关键步骤的参数条件等进行改进及进一步优选，与现有技术相比利用有效的筛选手段能够高效、快速获取甘蓝型油菜转基因苗，本发明将DsRed基因插入到含有目的基因的载体中，得到带有DsRed的目的载体转入农杆菌菌株，通过观察下胚轴的颜色能够快速高效的进行转基因阳性筛选；本发明中甘蓝型油菜的组织培养快速、高效进行遗传转化的方法，简化筛选并获得转基因阳性植株的周期，进而获得大量性状优良的植株，为深入研究油菜的遗传转化和性状改良提供良好的基础；并且，利用本发明所述方法，外植体的脱分化率在80％以上，愈伤组织的再分化率在80％以上，平均转基因效率在83.27％以上，获得的组培苗均可用于种植，移栽成活率高达100％。

为实现上述目的，按照本发明，提供了一种甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)无菌外植体的培养：将甘蓝型油菜种子灭菌后，播种到种子萌发培养基，暗培养6～7天；