[发明专利]一种弓形虫重组抗原的制备、弓形虫检测试剂盒及其制作方法

摘要

本发明涉及免疫学领域，公开了一种弓形虫重组抗原的制备方法，包括如下步骤：(1)弓形虫免疫兔血清的制备；(2)提取弓形虫基因组DNA；(3)GRA7基因的体外扩增和克隆；(4)原核表达载体的构建；(5)重组GRA7的表达与鉴定。还公开了弓形虫检测试剂盒，其包括PVC板，硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被弓形虫重组抗原，对照线上包被IgM抗体，还公开了弓形虫检测试剂盒的制备方法。本发明所得重组抗原对IgM抗体表现出高灵敏度；相对于现有技术，GRA7能被大量表达，转化效率高；本试剂盒对蛋白的检测简单，在免疫印迹上的时间上的时间短。

主权项

1.一种弓形虫重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，提取弓形虫基因组DNA弓形虫RH株速殖子自液氮中取出复苏后，腹腔接种小鼠，3d后，从小鼠腹水中收集弓形虫速殖子，PBS洗涤后，重悬于0.2mL含1％SDS的STE溶液中，补加蛋白酶K至0.1mg/mL，37℃消化过夜；用饱和酚、饱和酚氯仿、氯仿各抽提一次，提取出DNA，无水乙醇沉淀DNA，之后溶于TE缓冲液中，‑20℃冷存备用；步骤二，GRA7基因的体外扩增和克隆使用如下引物，正向引物：5′‑GGATCCATGGCCCGACACGCAAT‑3′；反向引物：5′‑GCGGCCGCCTGGCGGGCATCCTC‑3′，以步骤一所得基因组DNA作为模板扩增反应；GRA7基因扩增的DNA在1％琼脂糖凝胶中被染色成可见的赛博绿，然后，GRA7基因扩增的DNA被DNA纯化试剂盒切割和回收；步骤三，原核表达载体的构建步骤二中回收的DNA通过T‑载体PCR产物克隆试剂盒克隆到pTZ57R载体中，连接反应时，转化产物大肠杆菌L1‑Blue感受态细胞，涂布于含有100mg/mL氨苄西林的琼脂平板上，在含有X‑gal和IPTG的琼脂平板上筛选重组抗原和非重组抗原，用BamH1酶和Not1酶对重组质粒进行限制性酶切分析，GRA7片段通过DNA纯化试剂盒从1％琼脂糖凝胶中提取出来；步骤四，重组GRA7的表达与鉴定设定温度为37℃、搅拌速度为250rpm，含有pET28a‑GRA7的大肠杆菌菌株Top10F在含有卡那霉素的LB培养液中生长，蛋白质生长过程中加入1mM IPTG进行诱导表达，诱导时间为3h；进行12％SDS‑PAGE电泳分析。