[发明专利]一种弓形虫重组抗原的制备、弓形虫检测试剂盒及其制作方法

权利要求书

1.一种弓形虫重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，提取弓形虫基因组DNA

弓形虫RH株速殖子自液氮中取出复苏后，腹腔接种小鼠，3d后，从小鼠腹水中收集弓形虫速殖子，PBS洗涤后，重悬于0.2mL含1％SDS的STE溶液中，补加蛋白酶K至0.1mg/mL，37℃消化过夜；用饱和酚、饱和酚氯仿、氯仿各抽提一次，提取出DNA，无水乙醇沉淀DNA，之后溶于TE缓冲液中，-20℃冷存备用；

步骤二，GRA7基因的体外扩增和克隆

使用如下引物，正向引物：5′-GGATCCATGGCCCGACACGCAAT-3′；反向引物：5′-GCGGCCGCCTGGCGGGCATCCTC-3′，以步骤一所得基因组DNA作为模板扩增反应；GRA7基因扩增的DNA在1％琼脂糖凝胶中被染色成可见的赛博绿，然后，GRA7基因扩增的DNA被DNA纯化试剂盒切割和回收；

步骤三，原核表达载体的构建

步骤二中回收的DNA通过T-载体PCR产物克隆试剂盒克隆到pTZ57R载体中，连接反应时，转化产物大肠杆菌L1-Blue感受态细胞，涂布于含有100mg/mL氨苄西林的琼脂平板上，在含有X-gal和IPTG的琼脂平板上筛选重组抗原和非重组抗原，用BamH1酶和Not1酶对重组质粒进行限制性酶切分析，GRA7片段通过DNA纯化试剂盒从1％琼脂糖凝胶中提取出来；

步骤四，重组GRA7的表达与鉴定

设定温度为37℃、搅拌速度为250rpm，含有pET28a-GRA7的大肠杆菌菌株Top10F在含有卡那霉素的LB培养液中生长，蛋白质生长过程中加入1mM IPTG进行诱导表达，诱导时间为3h；进行12％SDS-PAGE电泳分析。

2.根据权利要求1所述的弓形虫重组抗原的制备方法，其特征在于：STE溶液由10mmol/L Tris-HCl、1mg/mL EDTA、0.15mmol/LNaCl组成，STE溶液的pH值为8.0。

3.根据权利要求1所述的弓形虫重组抗原的制备方法，其特征在于：PCR反应使用50ul的反应体系，反应体系包括50ngDNA，浓度为10pmol的1.5ul正向引物，浓度为10pmol的1.5ul反向引物，50mM MgCl₂，200mM DNTP，10×PCR缓冲液，2.5ul聚合酶。

4.根据权利要求1所述的弓形虫重组抗原的制备方法，其特征在于：PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s；58℃退火60s；72℃延伸60s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。

5.弓形虫检测试剂盒，其特征在于：包括PVC板、硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设有检测线、对照线；检测线上包被权利要求1～4所述弓形虫重组抗原，在对照线处包被IgM抗体；辣根过氧化物酶标记的抗人u链抗体。

6.根据权利要求5所述的弓形虫检测试剂盒，其特征在于：辣根过氧化物酶标记的抗人u链抗体放于含有5％牛奶的浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液中，抗人u链抗体与PBS缓冲液的体积比为1:1500。