[发明专利]BTV-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重RT-PCR试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种BTV‑11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重RT‑PCR试剂盒及其检测方法，用于单管同时鉴别检测蓝舌病病毒11型、17型、20型、23型、24型。本方法根据各型病毒VP2基因序列保守区设计了5对PCR特异性引物，此外借鉴GeXP原理合成一对非生物来源的通用引物，在各对特异性引物的上下游分别添加通用引物构成5对特异性嵌合引物，用特异性引物进行反转录，最后采用通用引物及特异性嵌合引物构建多重PCR。利用优化的多重PCR体系及条件，可单管同时鉴别检测这蓝舌病病毒5种基因型中的一种或多种，对BTV其它型及PPRV、FMDV核酸无特异性扩增，最低检测浓度可达到pg级。本发明方法灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果。

主权项

1.BTV‑11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重RT‑PCR试剂盒，其特征是：包括各型反转录引物管、Mix PCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管；所述各型反转录引物管如下：BTV‑11反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.2的BTV‑11下游引物0.5OD；BTV‑17反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.4的BTV‑17下游引物0.5OD；BTV‑20反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.6的BTV‑20下游引物0.5OD；BTV‑23反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.8的BTV‑23下游引物0.5OD；BTV‑24反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.10的BTV‑24下游引物0.5OD；所述Mix PCR反应液管由以下反应液组成：DNA序列为SEQ ID NO.11的100μmol/L的通用上游引物0.75μL；DNA序列为SEQ ID NO.12的100μmol/L的通用下游引物0.75μL；DNA序列为SEQ ID NO.13的10μmol/L的BTV‑11特异性嵌合上游引物0.375μL；DNA序列为SEQ ID NO.14的10μmol/L的BTV‑11特异性嵌合下游引物0.375μL；DNA序列为SEQ ID NO.15的10μmol/L的BTV‑17特异性嵌合上游引物0.625μL；DNA序列为SEQ ID NO.16的10μmol/L的BTV‑17特异性嵌合下游引物0.625μL；DNA序列为SEQ ID NO.17的10μmol/L的BTV‑20特异性嵌合上游引物0.25μL；DNA序列为SEQ ID NO.18的10μmol/L的BTV‑20特异性嵌合下游引物0.25μL；DNA序列为SEQ ID NO.19的10μmol/L的BTV‑23特异性嵌合上游引物0.25μL；DNA序列为SEQ ID NO.20的10μmol/L的BTV‑23特异性嵌合下游引物0.25μL；DNA序列为SEQ ID NO.21的10μmol/L的BTV‑20特异性嵌合上游引物0.25μL；DNA序列为SEQ ID NO.22的10μmol/L的BTV‑20特异性嵌合下游引物0.25μL；2X Premix Taq缓冲液12.5μL；灭菌去离子水2.5μL；合计20μL，为单次反应的用量；所述阳性对照管：管内为BTV‑11、BTV‑17、BTV‑20、BTV‑21、BTV‑23阳性重组质粒混合物；所述阴性对照管：管内为无BTV‑11、BTV‑17、BTV‑20、BTV‑23、BTV‑24的牛肉肌肉组织DNA样品；所述灭菌去离子水管：1000μL。