[发明专利]BTV-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重RT-PCR试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.蓝舌病病毒-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重RT-PCR试剂盒，其特征是：包括各型反转录引物管、Mix PCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管；

所述各型反转录引物管如下：

蓝舌病病毒-11反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.2 的蓝舌病病毒-11下游引物0.5OD；

蓝舌病病毒-17反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.4 的蓝舌病病毒-17下游引物0.5OD；

蓝舌病病毒-20反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.6 的蓝舌病病毒-20下游引物0.5OD；

蓝舌病病毒-23反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.8 的蓝舌病病毒-23下游引物0.5OD；

蓝舌病病毒-24反转录引物管：DNA序列为SEQ ID NO.10的蓝舌病病毒-24下游引物0.5OD；

所述Mix PCR反应液管由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO.11的100μmol/L的通用上游引物0.75μL;

DNA序列为SEQ ID NO.12的100μmol/L的通用下游引物0.75μL;

DNA序列为SEQ ID NO.13的10μmol/L的蓝舌病病毒-11特异性嵌合上游引物0.375μL;

DNA序列为SEQ ID NO.14的10μmol/L的蓝舌病病毒-11特异性嵌合下游引物0.375μL;

DNA序列为SEQ ID NO.15的10μmol/L的蓝舌病病毒-17特异性嵌合上游引物0.625μL;

DNA序列为SEQ ID NO.16的10μmol/L的蓝舌病病毒-17特异性嵌合下游引物0.625μL;

DNA序列为SEQ ID NO.17的10μmol/L的蓝舌病病毒-20特异性嵌合上游引物0.25μL;

DNA序列为SEQ ID NO.18的10μmol/L的蓝舌病病毒-20特异性嵌合下游引物 0.25μL;

DNA序列为SEQ ID NO.19的10μmol/L的蓝舌病病毒-23特异性嵌合上游引物0.25μL;

DNA序列为SEQ ID NO.20的10μmol/L的蓝舌病病毒-23特异性嵌合下游引物0.25μL;

DNA序列为SEQ ID NO.21的10μmol/L的蓝舌病病毒-20特异性嵌合上游引物0.25μL;

DNA序列为SEQ ID NO.22的10μmol/L的蓝舌病病毒-20特异性嵌合下游引物0.25μL;

2X Premix Taq 缓冲液 12.5μL;

灭菌去离子水2.5μL;

合计20μL，为单次反应的用量；

所述阳性对照管：管内为蓝舌病病毒-11、蓝舌病病毒-17、蓝舌病病毒-20、蓝舌病病毒-21、蓝舌病病毒-23阳性重组质粒混合物；

所述阴性对照管：管内为无蓝舌病病毒-11、蓝舌病病毒-17、蓝舌病病毒-20、蓝舌病病毒-23、蓝舌病病毒-24的牛肉肌肉组织DNA样品；

所述灭菌去离子水管：1000μL。

2.根据权利要求1所述蓝舌病病毒-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重RT-PCR试剂盒，其特征是：所述阳性重组质粒由如下步骤获得：分别以如下DNA序列引物组：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，按常规RT-PCR扩增，分别将PCR目的产物与PMD19-T载体进行连接，转化到DH5α后扩大培养提取质粒，并PCR鉴定、测序和NCBI-BLAST比对获得。

3.根据权利要求1所述蓝舌病病毒-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重RT-PCR试剂盒，其特征是：蓝舌病病毒-11、蓝舌病病毒-17、蓝舌病病毒-20、蓝舌病病毒-23、蓝舌病病毒-24在同一PCR反应管中进行特异性扩增，根据扩增片段的大小，将这5种基因型进行鉴别与区分。

4.利用权利要求1或2或3所述试剂盒进行蓝舌病病毒-11、蓝舌病病毒-17、蓝舌病病毒-20、蓝舌病病毒-23、蓝舌病病毒-24的多重RT-PCR非疾病诊断目的的检测方法：包括如下步骤：

待测样品cDNA模板制备：按照商品化病毒RNA提取试剂盒提取待测

样品全基因组,分别用各型反转录引物及商品化反转录试剂盒使用说明书，制备待测样品cDNA，取等量的待测样品cDNA混匀置于-20℃备用；

PCR扩增反应体系：20μL Mix PCR反应液,5μL待测样品cDNA模板或阳性对照或阴性对照，反应总体积为25μL;

PCR扩增反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，57℃退火30s，72℃ 30s，10个循环；95℃30s，50℃ 30s，72℃ 30S，25个循环；72℃ 5min，4℃保存；

结果判定：在Qesp100进行毛细管电泳后，阳性对照出现5个吸收峰分别为蓝舌病病毒-11在172-186bp间，蓝舌病病毒-17在221-239bp之间，蓝舌病病毒-20在317-343bp之间，蓝舌病病毒-23在377-409bp之间，蓝舌病病毒-24在266-288bp之间；阴性对照无吸收峰；样品在阳性对照位置相同的位置出现吸收峰则判定为该基因型阳性，无吸收峰出现则判定为该基因型阴性；阳性质控未出现目的条带或阴性对照出现条带，则结果无效。