[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞体外分离培养方法

摘要

一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其具体操作步骤包括顺次执行的机械分离胎盘羊膜组织、胰酶消化处理、胶原酶消化处理、细胞过滤、传代纯化、冻存检测。该方法简单易行，成本低廉，使用效果好，适用于大规模生产，且采用该方法来培养人胎盘羊膜间充质干细胞所获得的细胞数量大，而且产量高，稳定不易污染且培养成本低。

主权项

1.一种人羊膜间充质干细胞体外分离培养方法，其特征在于，包括以下操作步骤：1）准备羊膜间充质干细胞分离所需实验器材，用质量浓度为75%的酒精擦拭装胎盘采集盒，然后将胎盘转移到生物安全柜内的胎盘处理盘内，准备三个无菌培养皿，每个倒入60ml生理盐水以及质量比为1%的青链霉素备用；2）用灭菌好的尖头剪刀及止血钳配合沿脐带和胎盘连接处按4~5g每份取4~5g胎盘羊膜组织，放入其中一个无菌培养皿，用止血钳进行羊膜的血渍清洗，直至羊膜呈半透明或者透明态；3）将步骤2）方式处理过的羊膜转移至50ml离心管，用组织剪剪碎至1~2mm2大小，并加入胰酶溶液，封口放入恒温水浴锅中进行恒温低转速消化操作，消化完成后，利用100目钢筛过滤回收未消化完的组织块，将未过筛的未消化组织块转移回50ml离心管，重复上述消化步骤一次；4）将步骤3）方式处理过的组织物转移至新的50ml离心管中，加入胶原酶Ⅱ进行恒温低转速消化操作直至消化完全；5）将步骤4）中消化完全的悬液过滤孔孔径为100μm的细胞滤网，然后进行离心分离，然后用50ml生理盐水洗涤细胞并沉淀两次；6）向经过步骤5）处理的沉淀物中加入添加抗生素的新鲜培养基重悬细胞沉淀，在20000个/cm2的高密度条件下接种至T175培养瓶中，平置培养瓶，将培养瓶放置于CO2培养箱中进行细胞培养；7）将步骤6）中培养过24h的培养瓶取出，平置晃动数次，使未贴壁细胞漂浮起来，并倒出弃去，加10ml生理盐水洗两次，并补充含有抗生素的新鲜培养基，同时取换液的培养基2ml送检支原体，筛除支原体超标样品，放入CO2培养箱中继续细胞培养48~72h；8）待培养瓶中的细胞铺满瓶底的80~90%时进行细胞初次传代，将培养瓶中的上清液倒出，用生理盐水对瓶底细胞进行冲洗，然后培养瓶中加入胰酶进行胰酶消化处理，待瓶底细胞60~70%变圆脱落后加入生理盐水终止消化，用100μm的细胞滤网过滤，将过滤后的细胞悬液配平后进行离心分离；9）将步骤8）中离心分离后的上清倒弃，用移液管吹匀细胞后，取0.5ml进行细胞计数，将计数后细胞按9000~11000个/cm2进行传代接种至T75培养瓶中，利用十字交叉法混匀后在CO2培养箱中继续进行细胞培养；10）待培养瓶中的细胞铺满瓶底的80~90%时进行二次传代，进行二次传代操作时，将传代细胞按照2.5*106接种到T175培养瓶中进行培养，T175培养瓶中培养基体积为25ml，然后重复步骤8）以及步骤9）完成二次传代；11）待T175培养瓶中的细胞铺满瓶底80~90%时进行细胞冻存，将培养瓶中的培养基上清液倒出，加入适量的生理盐水冲洗细胞，每个培养瓶中用胰酶进行消化处理时，待瓶底细胞变圆脱落后加入生理盐水终止消化，将细胞悬液倒入新离心管中配平后进行离心分离，弃上清待用；12）取步骤11）处理后的离心管，先用3ml生理盐水吹散离心管底部细胞团，再用17ml生理盐水将细胞彻底吹打均匀；13）将步骤12）中取样后的细胞悬液定容至40ml，配平后离心分离，然后向离心管中细胞先加入2ml培养基吹打均匀，再加入2ml含有质量浓度为20%的DMSO的冻存培养基吹打均匀，然后均匀分装到3个细胞冻存管中即得成品干细胞。