[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞体外分离培养方法

说明书

一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其具体操作步骤包括顺次执行的机械分离胎盘羊膜组织、胰酶消化处理、胶原酶消化处理、细胞过滤、传代纯化、冻存检测。该方法简单易行，成本低廉，使用效果好，适用于大规模生产，且采用该方法来培养人胎盘羊膜间充质干细胞所获得的细胞数量大，而且产量高，稳定不易污染且培养成本低。

技术领域

本发明涉及生物科学领域中的干细胞分离技术，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞体外分离培养方法。

背景技术

间充质干细胞是一类能够自我更新，具有多向分化能力的干细胞。其最早是在骨髓中发现，后来经证实，在脂肪、骨膜、滑膜、肌肉、牙髓及脐血等多种组织中都存在这种细胞。羊膜是胎膜的重要组成部分，由发源于胚泡内细胞团的羊膜上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层构成，没有血管、神经、肌肉和淋巴组织。人羊膜的临床与基础研究迄今已有百余年的历史。早在1913年，Stern就报道了羊膜用于皮肤烧伤和溃疡的移植。随后，羊膜作为敷料在眼科、颅脑外科、妇科等各种手术中被广泛应用。然而直至近些年，人们对羊膜的生物学特性有了全新的、深入的认识，发现人羊膜细胞具有分化为3个胚层不同类型细胞的胚胎干细胞特征，并表现为低免疫原性和免疫抑制作用，移植后无排斥反应和致瘤性，还能产生众多细胞生长因子，如血小板源性生长因子（platelet derived growthfactor，PDGF）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）－β2、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）－1和－2。这些细胞因子参与促细胞增殖，减少炎症反应，调节损伤修复。因此，人羊膜细胞用作临床细胞治疗具有独特优势，是再生医学领域最有开发潜力的种子细胞资源，并作为干细胞的新来源入选美国《时代》杂志2007年度十大医学突破之一。

人羊膜间充质干细胞具有很好的分化潜能和可塑性，能够向多种细胞分化，向肝细胞分化、向神经细胞分化、向心肌细胞分化、向胰腺β细胞分化、向成骨细胞分化、向软骨细胞分化、向肺泡上皮细胞分化等，可塑性极强。

人羊膜干细胞的具有很高的临床研究价值，人羊膜组织良好特性，在结膜损伤修复、重建眼表、防治睑球粘连与视网膜移植等眼科临床已开展了大量工作，而且在糖尿病难愈性皮肤溃疡、烧伤等创面修复愈合方面有积极的疗效。近十余年来，人羊膜组织来源的干细胞在临床应用方面也做了前瞻性工作，展示了巨大的临床应用潜力。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种人羊膜间充质干细胞体外分离培养方法，以解决现有技术中分离困难、操作复杂、易污染、产量低、培养效果差等技术难题。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种人羊膜间充质干细胞体外分离培养方法，包括以下操作步骤：

1）准备羊膜间充质干细胞分离所需实验器材，用质量浓度为75%的酒精擦拭装胎盘采集盒，然后将胎盘转移到生物安全柜内的胎盘处理盘内，准备三个无菌培养皿，每个倒入60ml生理盐水以及质量比为1%的青链霉素备用。

2）用灭菌好的尖头剪刀及止血钳配合沿脐带和胎盘连接处按4~5g每份取4~5g胎盘羊膜组织，放入其中一个无菌培养皿，用止血钳进行羊膜的血渍清洗，直至羊膜呈半透明或者透明态。

3）将步骤2）方式处理过的羊膜转移至50ml离心管，用组织剪剪碎至1~2mm²大小，并加入胰酶溶液，封口放入恒温水浴锅中进行恒温低转速消化操作，消化完成后，利用100目钢筛过滤回收未消化完的组织块，将未过筛的未消化组织块转移回50ml离心管，重复上述消化步骤一次。