[发明专利]用于检测靶基因突变体变异的方法、组合物和试剂盒

摘要

本发明公开了用于检测含有过量野生型核酸的样品中靶核酸的稀有变化、突变或多态性的方法、组合物和试剂盒，本发明使用通用PCR引物和通用检测序列扩增和检测不同靶序列，从而可以在单管反应中检测多个靶序列中的任何靶序列的存在并且定量多个靶序列的总量，本发明用于检测稀有突变体的方法具有高特异性和选择性，可容易地针对不同靶序列进行优化，并且可以适应复用自动化，本发明还公开了用于检测靶基因/染色体的拷贝数变异的方法。

主权项

1.一种用于检测核酸样品中的靶序列的方法，包括以下步骤：(a)提供含有靶特异性部分和通用引物结合与通用检测部分的靶捕获探针；(b)从下列中选择靶捕获探针：(i)一条多核苷酸单链，所述单链从5'到3'末端依次包括5'‑靶特异性序列(5'‑TSS)、正向通用引物结合序列(正向UPBS)、可断裂位点、反向通用引物结合序列(反向UPBS)和3'‑靶特异性序列(3'‑TSS)，并且具有插入所述正向UPBS与所述5'‑TSS或者所述反向UPBS与所述3'‑TSS之间的通用检测序列，或者(ii)两条多核苷酸单链，包括包含耐外切核酸酶的5'末端、反向UPBS和在所述3'末端的3'‑TSS的第一多核苷酸链，以及包含在所述5'末端的5'‑TSS、正向UPBS和耐外切核酸酶的3'末端的第二多核苷酸链，并且具有插入所述正向UPBS与所述5'‑TSS之间或者所述反向UPBS与所述3'‑TSS之间的通用检测序列；(c)在其中所述靶捕获探针的3'‑TSS和5'‑TSS退火到所述核酸样品中的互补序列而形成双链体核酸的条件下，使所述靶捕获探针与所述核酸样品接触；(d)执行靶选择性连接，其中将所述靶捕获探针的3'‑TSS与5'‑TSS加以连接而形成线性或环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物；(e)任选地，利用外切核酸酶来消化敏感的核酸，在所述酶消化后，失活所述外切核酸酶并且/或者纯化所述耐外切核酸酶的靶特异性连接产物；(f)在所述可断裂位点处使所述环状耐外切核酸酶的靶特异性连接产物(如果存在)断裂，从而获得线性靶特异性连接产物；(g)通过使用识别所述通用引物结合序列或其互补序列的通用PCR引物的聚合酶链反应(PCR)，而扩增所述线性靶特异性连接产物或所述线性耐外切核酸酶的靶特异性连接产物；以及(h)利用识别所述通用检测序列或其互补序列的序列特异性报告探针检测或定量所述线性靶特异性连接产物或所述线性耐外切核酸酶的靶特异性连接产物，作为所述靶序列的测量。