[发明专利]用于检测靶基因突变体变异的方法、组合物和试剂盒

说明书

本发明公开了用于检测含有过量野生型核酸的样品中靶核酸的稀有变化、突变或多态性的方法、组合物和试剂盒，本发明使用通用PCR引物和通用检测序列扩增和检测不同靶序列，从而可以在单管反应中检测多个靶序列中的任何靶序列的存在并且定量多个靶序列的总量，本发明用于检测稀有突变体的方法具有高特异性和选择性，可容易地针对不同靶序列进行优化，并且可以适应复用自动化，本发明还公开了用于检测靶基因/染色体的拷贝数变异的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年2月19日提交的美国临时专利申请第62/460,806号 和2018年2月4日提交的美国专利申请第15/888,042号的权益，所述临时专利 和专利申请的内容以参考的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及分子诊断学领域中的方法和技术，特别是涉及用于检测含有过量 野生型序列的样品中靶核酸的稀有突变体变异的方法、组合物和试剂盒。使用通 用PCR引物和通用检测序列，本发明提供一种用于在单管反应中同时检测多达数 千个靶序列的方法。

背景技术

本发明涉及用于检测含有过量野生型核酸的样品中靶核酸的稀有改变、突变 或多态性的方法、组合物和试剂盒。本发明使用通用PCR引物进行扩增，并使用 通用检测序列来检测不同的靶序列，从而可以检测多个靶序列中的任意靶序列的 存在并且在单管反应中定量多个靶序列的总量。本发明用于检测稀有突变体的方 法具有高特异性和选择性，可容易地针对不同靶序列进行优化，并且可以适应复 用自动化。

核酸的许多突变体变异(例如单核苷酸多态性(SNPs)、插入/缺失、基因融合、 具有改变的甲基化模式的变异和拷贝数变异)与遗传性疾病、疾病的易感性、耐 药性的倾向性以及疾病的进展有关，这些突变体变异可以被用作用于疾病的诊断、 预测和治疗的重要生物标志物。因此，用于有效检测突变体变异的方法和技术在 临床应用(包括诊断早期疾病、检测产前遗传性疾病、作出预后预测和设计有效 的治疗模式)中发挥越来越重要的作用。在许多情况下，要求在野生型序列或替 代变异的高背景下检测和定量稀有疾病相关的突变体变异。例如，一些低丰度体 细胞突变被证明与癌症预后和治疗效果有关，并且在母体DNA的背景中对小部分 的胎儿DNA的测定对于产前遗传性疾病的检测是必不可少的。对于循环无细胞 DNA样品中的体细胞突变或胎儿DNA的检测要求具有高灵敏度和特异度的方法。

尽管在临床应用中有很大的潜力，但对在过量野生型序列或替代变异存在下 以高特异性和准确性检测稀有突变体带来了巨大的技术挑战。野生型序列的量常 常比生物样品中的稀有突变体变异的量高100倍以上，从而导致对轻微突变体的 检测受到很大抑制。检测方法可能不具备足够的灵敏度以便对轻微突变体进行检 测。包括连接、杂交、野生型阻断剂、DNA聚合酶或核酸酶在内的各种方法已试 图克服所述问题。另外，临床样品中的起始物受到限制(例如，5-20ng的总DNA) 并且需要进行多次诊断测试，这对测试方法的高灵敏度和特异度提出了严格要求。

等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)是一种广泛应用的用于选择性地扩 增和检测突变体变异的方法(Wu DY,Ugozzoli L,Pal BK,Wallace RB,Proc Natl Acad SciUSA 1989；86:2757-2760；Chen X和Sullivan PF,The Pharmacogeonomics Journal 2003；3:77-96)。AS-PCR利用与突变等位基因的靶 多态位点为互补的等位基因特异性PCR引物来选择性地扩增突变体变异。AS-PCR 的选择性和特异性主要是取决于DNA聚合酶的保真性，所述DNA聚合酶在具有错 配的3'末端的情况下以比具有匹配的3'末端的情况低得多的效率使引物延伸。 然而，指数式PCR扩增使得此辨别力快速衰减并且经常发生明显的错配扩增。此 方法的鉴别能力也受到野生型与突变等位基因的比率及在多态性碱基附近的序 列的影响。