[发明专利]一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：步骤一：血液样本：预先准备好血液样本、Magen磁珠法组织与D6312血液DNA提取试剂盒，步骤二：细胞裂解：(a)取一个灭菌的1.5ml离心管，加入20ul蛋白酶K，再取200ul血液样本加入到离心管中，立即震荡混匀1秒。本发明通过优化其提取实验步骤和流程从而获取到高纯度、高完整性的高分子量DNA片段，可以满足下游Long‑read测序的需要，DNA无RNA和蛋白污染，DNA片段完整性高，无降解，单个样本提取时间要比常规提取时间短一些，而且也可以进行多个样本的提取，且提取时间并不会增加很多，DNA分子在45kb以上，最大达到130kb左右，结果非常好，完全适合Long‑read测序技术。

主权项

1.一种基于试剂盒的针对人血液中高分子量基因组DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：血液样本：预先准备好血液样本、Magen磁珠法组织与D6312血液DNA提取试剂盒；步骤二：细胞裂解：(a)取一个灭菌的1.5ml离心管，加入20ul蛋白酶K，再取200ul血液样本加入到离心管中，立即震荡混匀1秒；(b)立即加入200ul AL，迅速震荡混匀，如果样本量过多，必须单独进行加样以及AL的加入，尽量缩短加液和震荡混匀之间的时间间隔；(c)震荡混匀后，放到掌式离心机上短离1秒，进行温浴，温浴期间每隔3分钟取出轻轻地缓慢地180°颠倒混匀3‑5次，不要进行离心，放回继续温浴即可；(d)温浴后，加入400ul buffer BD和20ul MagBind Particle，轻轻缓慢地180°颠倒混匀20‑30次，室温静置3分钟，期间再轻轻地颠倒混匀数次；(e)静置后，将离心管短离0.5秒，只需要将管盖和管壁上的液体离心下去即可，尽量不要让离心机速度完全升上来；步骤三：磁珠结合：将离心管放到磁力架上，吸附5分钟，然后将废液完全吸净弃掉；步骤四：高盐溶液洗涤三次：加入800ul的BW1buffer，盖上盖子，轻轻的180°颠倒磁力架使BW1buffer完全清洗离心管的内部(包括管盖)，180°颠倒清洗1分钟后再静置1分钟，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量洗干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，该步骤中所有的动作需要温柔，且加液的时候不要碰到磁珠，再重复上述步骤两次；步骤五：乙醇洗涤三次：加入800ul的乙醇，盖上盖子，轻轻地180°颠倒磁力架使乙醇完全清洗离心管的内部(包括管盖)，颠倒清洗1分钟后，然后放到磁力架上吸附3分钟后吸掉废液，在吸掉废液的时候保持离心管在磁力架上，并尽量吸干净离心管内部的所有废液，包括管底、管盖及管壁上的废液，再重复上述步骤两次；步骤六：DNA回溶：(a)将离心管从磁力架上取下，盖上盖子，短离3次，每次0.5秒，每次离心的速度尽量不要过大，以避免对DNA片段造成影响，只需要把管盖及管壁上的大部分液体离心至管底即可，如果管壁有残留的小块儿液体并无影响；(b)将离心管放到磁力架上开盖吸附2分钟，吸掉管底的残留液体，然后开盖晾干5‑10分钟，晾干过程中如果管壁有残留的小块儿液体，用枪头将液体打散以加速液体的蒸发；另外晾干时间按实际情况而定，当管壁上的液体蒸发干净以及磁珠失去光泽后即可闭盖停止晾干；(c)将离心管从磁力架上取下，每管加入32ul的EB，用移液器轻轻地将吹打磁珠，使之从管壁上剥落至液体里，然后盖上管盖，轻弹混匀，进行温浴，温浴期间，每隔1‑2分钟取出轻弹混匀；(d)将离心管放到磁力架上吸附5分钟，然后将DNA溶液转移至新的1.5ml离心管内。