[发明专利]一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法

摘要

本发明公开了一种乳制品中A2‑β‑酪蛋白含量的检测方法，包括准备样品和标准品：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳离心脱脂；加入缓冲液，涡旋混匀，静置10‑120min，离心5‑20min；取下清液，加入缓冲液定容，涡旋混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测；HPLC检测分析，采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：0.1%三氟乙酸、流动相B：0.1%乙腈。本发明检测分析方法可以实现对于普通牛奶中A1‑β‑酪蛋白和A2‑β‑酪蛋白亚型状态检测分析研究，通过预处理以及色谱条件的协同调整，实现对于两种亚型的充分分离，进而结合标准品进行快速判断牛乳原料是否属于纯品A2‑β‑酪蛋白亚型牛乳替代现有基因检测分析方法，简化检测分析研究的难度，降低检测分析成本。

主权项

1.一种乳制品中A2‑β‑酪蛋白含量的检测方法，包括以下步骤：S1、准备样品和标准品：101样品准备：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳离心脱脂；加入缓冲液，涡旋混匀，静置10‑120min，离心5‑20min；取下清液，加入缓冲液定容，混匀，用0.45μmPTFE滤膜过滤过滤，待上机检测；102标准品准备：称取αs‑酪蛋白、β‑酪蛋白、κ‑酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入缓冲液，溶解均匀，加入缓冲液定容，过滤，得到已知酪蛋白浓度的待上机检测的标准品；S2、色谱检测：采用高效液相色谱依次检测标准品和样品，根据标准品中各个酪蛋白的保留时间，确定样品中相应酪蛋白成分的保留时间以及峰面积，计算各种酪蛋白的含量；色谱参数如下：色谱柱：ZORBAX 300A Stalle Bond 300SB‑C8 4.6*250 5μm；采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：0.1％三氟乙酸、流动相B：0.1％乙腈，洗脱程序：时间/min流动相A/％流动相B/％流速/mL/min075.724.31271.228.811764.835.213061.838.214555.045.014846.054.015346.054.015575.724.316575.724.31进样量：50μL；柱温：40℃；检测波长：241nm；所述β‑酪蛋白通过以下分离纯化方法制备得到，具体制备过程包括以下步骤：(B1)将已知A1‑β‑酪蛋白牛奶或已知A2‑β‑酪蛋白牛奶，1‑6℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至30‑35℃，调节pH＝11‑11.5，搅拌，加入钙盐溶液使奶样中钙离子浓度为0.05‑0.07mol/L；(B2)调节pH＝7.0‑7.5，离心，倾倒上层清液，加入20‑60mL水搅拌至固体蛋白呈乳浊液，离心，倾倒上清液，再次加入20‑60mL水搅拌至固体蛋白呈乳浊液，离心，倾倒上清液；(B3)将固体蛋白加入80‑150mL pH＝11‑12的碱性水溶液，搅拌溶解，降温至1‑6℃，保温1‑5h；(B4)调节pH＝4.55‑4.65，1‑6℃冷冻离心，收集上清液，升温至28‑34℃，保持10‑50min；(B5)离心，收集沉淀，用水洗涤，丙酮洗涤，30‑50℃烘干或者冷冻干燥，得到A1‑β‑酪蛋白或A2‑β‑酪蛋白，冷冻保存。