[发明专利]一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法

说明书

本发明公开了一种乳制品中A2‑β‑酪蛋白含量的检测方法，包括准备样品和标准品：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳离心脱脂；加入缓冲液，涡旋混匀，静置10‑120min，离心5‑20min；取下清液，加入缓冲液定容，涡旋混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测；HPLC检测分析，采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：0.1%三氟乙酸、流动相B：0.1%乙腈。本发明检测分析方法可以实现对于普通牛奶中A1‑β‑酪蛋白和A2‑β‑酪蛋白亚型状态检测分析研究，通过预处理以及色谱条件的协同调整，实现对于两种亚型的充分分离，进而结合标准品进行快速判断牛乳原料是否属于纯品A2‑β‑酪蛋白亚型牛乳替代现有基因检测分析方法，简化检测分析研究的难度，降低检测分析成本。

技术领域

本发明涉及一种酪蛋白含量检测方法，特别涉及一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，特别是牛乳中酪蛋白检测分析，属于乳制品领域。

背景技术

牛奶中含有丰富的营养成分，每一杯250mL的牛奶中固含量为30-38克，包括10-20克乳糖、5-7克脂肪、2-2.5克矿物质以及7-10克蛋白质。因此，牛奶被广泛的推荐作为青少年健康饮品，补充青少年生长发育阶段对于各种营养成分的需求。

牛奶蛋白含量丰富，同时其中蛋白质又被分为酪蛋白和乳清蛋白，乳清蛋白是指溶解分散在乳清中的蛋白，酪蛋白则主要是含磷钙的结合蛋白。因此，酪蛋白既可以为人体提供氨基酸来源，又可以作为磷、钙元素的来源，对于幼儿生长发育具有重要意义。

在牛奶酪蛋白中30-35％是β-酪蛋白，β-酪蛋白有多种变体，最常见是A1和A2亚型。他们的区别是组成这种蛋白质的209个氨基酸中的一个氨基酸不同，氨基酸链的第67位是脯氨酸(proline)的酪蛋白是A2-β-酪蛋白，第67位是组氨酸(histidine)的则是A1-β-酪蛋白。两种β-酪蛋白在结构上的细微差别意味着它们被吸收的情况也有所不同。A2-β-酪蛋白相比于A1-β-酪蛋白，在消化酶作用下产生β-酪啡肽-7更少，可以有效的减少BCM-7类鸦片活性肽对于肠道活性影响，更有利于人体吸收利用、健康。

随着现代社会消费升级，对于更加健康安全的乳制品提出更高要求，A2牛奶近年来在中国市场取得非常好的市场效应。目前能够参照的技术手段主要是牛只基因鉴定法，基因鉴定法主要针对牛只的基因鉴定，但是对于某一未知牛乳样品基因型鉴定不适用。针对市售牛乳产品中β-酪蛋白的构型确认及具体含量如何，需要开发一种通用的检测方法。

发明人在大量的研究工作总结以后，提出了通过HPLC色谱法快速检测分析牛乳中酪蛋白类型的方法，但是市场上对于A1、A2亚型β-酪蛋白标准品的提供较少，难以满足检测分析的需求。

现有技术中也提供一些关于酪蛋白检测分离的方法，但大多仅限于αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白三大类型的检测和分离，并没有关于β-酪蛋白A1和A2类型的拆分研究。

市场销售或者一般途径得到的牛乳样品(或者干酪素)均为A1和A2的混合样，采购的标准品β-酪蛋白也是两种构型的混合物。缺少标准品的情况下，在技术检测上不能明确色谱图上两个峰所代表的具体成分，无法进行定性及定量分析，也就无法确定不同的酪蛋白的类型，也就无法准确的检测分析不同的酪蛋白含量。

现有资料上看，利用液相色谱检测技术得到的色谱图上，β-酪蛋白出现两个色谱峰，但是在文献资料中并未明确指出两个峰所代表的β-酪蛋白基因构型。导致该现象的原因主要是，市场销售或者一般途径得到的牛乳样品(或者干酪素)均为A1和A2的混合样，采购的标准品β-酪蛋白也是两种构型的混合物。所以，在技术检测上不能明确色谱图上两个峰所代表的具体成分。

A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白标准物质的缺乏，无法在市场上购买到商品化的标准品物，进而导致A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白定量检测无法实现。现有文献中对于β-酪蛋白定量的测定主要集中在两种混合物的定量检测上，作为A2的研究存在缺陷。