[发明专利]一种人凝血因子VIII的制备方法

摘要

本发明属于生物制药和血液制品技术领域，尤其涉及一种人凝血因子VIII的制备方法，本发明通过对人凝血因子Ⅷ制备过程进行总体研究，对冷沉淀制备、溶解、洗涤液和洗脱液进行筛选，洗脱后山梨酯80、磷酸三丁酯残留量均达到现行药典的要求；透析液进行筛选，最终得到的产品无塌陷、无萎缩，复溶时间快，干热灭活后的FⅧ效价为28.9IU/ml，本发明对制备FⅧ的各个工艺步骤进行优化筛选，得到最优的方案，通过计算各个步骤的回收率，最后得到的FⅧ的回收率为28.91％，有效的增加了血浆制备FⅧ的效率，间接节约了稀缺血浆资源。

主权项

1.一种人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)冷沉淀制备：制备血浆冷沉淀；/n2)溶解：冷沉淀溶解，得溶解液；/n3)酸沉淀：用醋酸溶液调节溶液pH，并降温至14℃ ± 2℃，酸沉淀后离心收集上清液，出液温度15± 5℃，离心机出液速度≤5000ml/min；/n4)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：将步骤3)得到的上清液中加入DEAE Sephadex A-50凝胶吸附，吸附后离心收集上清液；DEAE Sephadex A-50凝胶的用量为每份血浆冷沉淀干胶用量为0.0025份；/n5)S/D病毒灭活：将步骤4)得到的上清液用S/D灭活剂进行灭活，使制品聚山梨酯80的量为1± 0 .3％g/g，磷酸三丁酯的量为0 .3± 0 .1％g/g，制品蛋白浓度≤50mg/ml，灭活温度24± 1℃，灭活时间为6h；/n6)TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析：柱平衡液冲洗5-6个柱体积，将步骤5)得到的灭活液进行上样，洗涤液洗涤至基线平稳，洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得洗脱液；/n7)超滤：步骤6)得到的洗脱液进行浓缩，得浓缩液，浓缩液用透析液进行6-7倍体积透析，最后一次透析完后浓缩至人凝血因子Ⅷ 效价为30IU/ml以上；/n8)半成品制备：将步骤7)得到的人凝血因子Ⅷ 溶液，按出品规格用超滤透析液进行配制，制品pH为7 .0± 0.5，除菌过滤；/n9)成品制备：将步骤8)得到的人凝血因子Ⅷ 溶液进行分批、分装，冻干，压塞出柜，干热病毒灭活，包装既得；/n所述的制备血浆冷沉淀，其循环水温度为28℃，搅拌速度为95r/min，离心转速为13800r/min，出液温度为2℃，进液速度为3.3kg/min；/n所述的冷沉淀溶解，肝素钠的注射用水溶液加入量为沉淀的4 .1倍，溶解温度为11℃，溶解时间为1 .8h，用醋酸溶液调节溶液pH值至7 .0，继续溶解30min；/n所述的柱平衡液，其为90mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙，pH 6 .9-7 .1，温度15± 5℃；/n所述的洗涤液 ，120mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 6 .9-7 .1，温度15± 5℃；/n所述的洗脱液 ，200mmol/L氯化钠，20mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 7 .0，温度15± 5℃；/n所述的透析液 ，50mmol/L氯化钠，6mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，6 .7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸，pH7 .0± 0.5；/n所述的冻干，隔板温度降至-45℃，并保持3 .6h；搁板温度2 .5h升温至-30℃，保持13h；隔板经32h升温至0℃，保持13 .7h；搁板温度4h升温至30℃，保温11 .5小时；其中在冷冻干燥和解析干燥过程中真空度不大于30Pa；/n所述的酸沉淀，是用pH等于6.9的酸溶液；/n所述TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析，其柱子高20cm，层析流速为110cm/h。/n