[发明专利]一种人凝血因子VIII的制备方法

说明书

本发明属于生物制药和血液制品技术领域，尤其涉及一种人凝血因子VIII的制备方法，本发明通过对人凝血因子Ⅷ制备过程进行总体研究，对冷沉淀制备、溶解、洗涤液和洗脱液进行筛选，洗脱后山梨酯80、磷酸三丁酯残留量均达到现行药典的要求；透析液进行筛选，最终得到的产品无塌陷、无萎缩，复溶时间快，干热灭活后的FⅧ效价为28.9IU/ml，本发明对制备FⅧ的各个工艺步骤进行优化筛选，得到最优的方案，通过计算各个步骤的回收率，最后得到的FⅧ的回收率为28.91％，有效的增加了血浆制备FⅧ的效率，间接节约了稀缺血浆资源。

技术领域

本发明属于生物制药和血液制品技术领域，尤其涉及一种人凝血因子VIII的制备方法。

背景技术

人凝血因子(human coagulation factorVIII，FVIII)是从健康人血浆分离制备的主要含FⅧ的血浆蛋白制品，主要用于治疗甲型血友病(hemophiliaA，HA)。据世界卫生组织(WHO)和世界血友病联盟(WorldFederationofHemophilia，WFH)报告，全球HA的发病率为15-20/10万，中国约2.27-2.84/10万，对于HA患者需要终生输注FⅧ来维持正常生活(梁小明，黄潘，周星，等.人凝血因子Ⅷ提取工艺研究[J].安徽农业科学，2013，41(30):12043－12044，12048.)。

目前，FⅧ市场仍然呈紧张势态，由于血浆中FⅧ含量甚微，浓度约50-100ng/ml，且极不稳定，传统制备方法收率不高，纯度较低，比活性小于10IU/mg，含有大量杂蛋白，临床使用中副反应大。此外，国内生产FVIII的厂家较少。国内已有专利对FVIII生产工艺进行改进，如申请号CN201410496187.9《一种人凝血因子VIII的制备方法》，采用铝胶吸附，S/D病毒灭活，凝胶柱层析纯化，及超滤浓缩，但其主要对冻干保护3剂进行了优化，得到的产品收率和比活均有所提高，但难以满足市场需求。申请号CN101710678003.4《一种人凝血因子VIII的制备方法》，通过对冷沉淀溶解之后时采用两部压滤法提高了分离效果，并在冻干工艺中增加了复溶复冻工艺，提高了产品的安全性，但其制备步骤较多，增加了成本投入。申请号CN201510748334.1，公开了《一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法》，步骤包括：(1)冷沉淀与组分I同时投料、溶解；(2)DEAE SephadexA-50凝胶吸附；(3)S/D病毒灭活；(4)阴离子交换柱层析；(5)层析穿透液经两步低温乙醇沉淀纯化、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得人纤维蛋白原；(6)层析洗脱液进一步疏水柱层析；(7)疏水柱洗脱液经超滤、纳米膜过滤、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得高纯人凝血因子VIII，但其整个工艺过程中，人凝血因子VIII的回收率较低，造成了血浆的浪费。黄璠等对人凝血因子Ⅷ生产冷沉淀制备工艺的优化，提高人凝血因子Ⅷ的质量和产量(黄璠,梁小明,张丽铃,等.人凝血因子Ⅷ生产冷沉淀制备工艺的优化[J].现代医药卫生,2014(15):2254-2255.)；牟蕾等对冻干保护剂配方，得到纯度较高、稳定性和安全性较好的FⅧ制品，确定的保护剂配方对干热灭活的耐受性良好(牟蕾,鲁涛,王黔川,等.一种离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ方法的建立及保护剂配方的筛选[J].中国生物制品学杂志,2015,28(11):1206-1210.)。

综上所述，现有的技术没有全面的对生产过程进行因此优化，因此，优化人凝血因子Ⅷ(FⅧ)原液制备工艺，提高FⅧ收得率及纯度的方法势在必行。

发明内容

本发明以上技术问题，提供了一种人凝血因子VIII的制备方法。

具体是通过以下技术方案来实现的：

一种人凝血因子VIII的制备方法，包括如下步骤：

1)冷沉淀制备：制备血浆冷沉淀；

2)溶解：冷沉淀溶解，得溶解液；