[发明专利]一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法和应用

摘要

本发明公开了一种重组酶聚合酶恒温扩增结合胶体金试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，步骤如下：设计特异性的金黄色葡萄球菌引物对，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行重组酶聚合酶恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。本发明方法快速简便，不需要昂贵的仪器设备，在40℃恒温条件下仅需扩增10min就可产生可检测水平的产物，不需要繁琐的电泳过程，用胶体金试纸条检测5min内即可获取结果，结果直接肉眼观察；另外，本方法特异性强，未与其他菌属发生反应，灵敏度高，弥补了现有传统检测技术的不足。本方法有望应用于基层检验检疫机构，成为常规检测手段，对于提高食品卫生水平，保证食品安全和推动食品国际贸易发展具有重要意义。 1

主权项

1.一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：步骤如下：

设计对金黄色葡萄球菌具有特异性的引物对，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。

2.根据权利要求1所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述引物对为：

正向引物的核苷酸序列SEQ1：GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG；

反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT。

3.根据权利要求2所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述正向引物的5，端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5，端用生物素biotin标记。

4.根据权利要求1所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述胶体金试纸条包括背板、金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述背板沿水平方向设置，该背板上由左至右依次相连接设置金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处部分重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置羊抗鼠抗体。

5.根据权利要求4所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述背板为带有不干胶的衬垫。

6.根据权利要求4所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述金标垫的制备步骤如下：

⑴制备胶体金

根据柠檬酸钠还原法制备胶体金方法制备20nm的胶体金，方法如下：

将含转子的锥形瓶中加入100mL超纯水，加热煮沸后保持3min后弃除水分；取99mL超纯水和1mL质量浓度为1％的已过滤的氯金酸加至锥形瓶，加热至沸腾煮沸后加入2.25mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠不断搅拌，溶液变至酒红色，颜色保持稳定不再变化时，再继续加热15min；溶液冷却至室温，用超纯水恢复至原始体积，得胶体金，4℃避光保存；

⑵胶体金标记抗体

取1mL步骤⑴的胶体金，加入18μL 0.2mol/LK₂CO₃调节胶体金至pH＝8.5，取10μL抗地高辛抗体加到胶体金溶液中，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃静置1h，滴加混合后溶液总体积2％的质量浓度为20％的BSA溶液，混合后溶液总体积1％的质量浓度为20％的PEG 20000溶液，混匀后，得混合后溶液，混合后溶液于4℃静置30min，然后2000rpm，4℃，离心15min，取上清液至干净的离心管中，10000r/min，4℃，离心30min，弃除上清液，胶体金颗粒沉淀用5倍体积的金标复溶液复溶，将溶液以30μL/cm喷涂在金标垫上，真空干燥过夜。

7.根据权利要求1至6任一项所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：具体步骤如下：

⑴RPA反应体系：

10μM正向引物和反向引物各2.4μL，1×rehydration buffer 29.5μL，5ng样品模板DNA2.5μL，双蒸水10.7μL，重组酶聚合酶，280mmol/μL乙酸镁2.5μL，反应总体积50μL；

⑵RPA反应体系扩增：

向无菌离心管中依次加入rehydration buffer、双蒸水、正向引物、反向引物、模板DNA和重组酶聚合酶，充分振荡混匀，最后加入280mmol/μL乙酸镁，充分混合，简短离心，40℃水浴锅反应10min，取出反应管，得扩增产物；

⑶试纸条检测：

取100μL扩增产物到900μL PBST中混合，然后将混合液滴加到胶体金试纸条上，室温下静置5min，通过试纸条显色情况判断扩增结果；

当试纸条检测线、质控线都有条带出现，说明结果阳性，存在金黄色葡萄球菌；若只有质控线有条带，检测线位置无条带则说明结果阴性，不存在金黄色葡萄球；若质控线未出现条带，结果无效。

8.一种如权利要求1至7任一项所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法在金黄色葡萄球菌的检测中的应用。