[发明专利]一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组酶聚合酶恒温扩增结合胶体金试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，步骤如下：设计特异性的金黄色葡萄球菌引物对，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行重组酶聚合酶恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。本发明方法快速简便，不需要昂贵的仪器设备，在40℃恒温条件下仅需扩增10min就可产生可检测水平的产物，不需要繁琐的电泳过程，用胶体金试纸条检测5min内即可获取结果，结果直接肉眼观察；另外，本方法特异性强，未与其他菌属发生反应，灵敏度高，弥补了现有传统检测技术的不足。本方法有望应用于基层检验检疫机构，成为常规检测手段，对于提高食品卫生水平，保证食品安全和推动食品国际贸易发展具有重要意义。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，涉及针对金黄色葡萄球菌的恒温扩增快速检测技术，尤其是一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法和应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)广泛存在于自然界中，主要污染肉类、乳制品和蔬菜等，都可以引起人和动物患病，可导致多种类型的感染，如：皮肤软组织感染、关节炎、蜂窝织炎、乳腺炎、坏死性肺炎、眼眶蜂窝组织炎、心内膜炎和败血症等。在全世界范围内，金黄色葡萄球菌都是导致食物中毒最重要的食源致病微生物之一。美国疾病控制中心 (CDC)的报告显示，所有细菌性食物中毒事件中，33％是由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的，其数量仅低于大肠杆菌。在加拿大，其比例更是高达45％，在我国，由金黄色葡萄球菌导致的细菌性食物中毒事件约占总体中毒事件的20％～25％，因此现在世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。

目前金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括细菌分离鉴定，免疫学方法，分子生物学方法等。细菌分离鉴定工作量大，成本较低，但检测周期长，灵敏度低；免疫学方法易交叉污染，假阳性严重，灵敏度偏低；分子生物学方法应用最广泛的是PCR，但操作繁琐耗时，必须依赖昂贵的实验设备，不便于在基层或现场检测进行推广。

近年来，重组酶聚合酶(RPA)方法受到关注，该方法是一种新型核酸扩增技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，自2006年问世后，已应用于农业、食品安全、医学和转基因检测等多个领域。可在恒温条件下(37℃～42℃)实现对核酸的快速、特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，被认为是最接近所谓的“等温扩增”，具有广阔的应用前景。胶体金试纸条(LF)最大的特点是快捷迅速、灵敏准确、安全简便、成本低廉且不需要专业人员和仪器设备，通常几分钟内就可用肉眼观察到的检测结果。本发明将恒温扩增技术可以简便快捷地检测金黄色葡萄球菌。

通过检索，尚未发现与本发明申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法和应用，该方法具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作简单、便携式的特点。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测金黄色葡萄球菌的方法，步骤如下：

设计对金黄色葡萄球菌具有特异性的引物对，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。

而且，所述引物对为：

正向引物的核苷酸序列SEQ1：GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG；

反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT。

而且，所述正向引物的5’端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5’端用生物素biotin 标记。