[发明专利]一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：1）设计合成嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒；2）重组表达嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶；3）嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶亲和纯化；4）检测嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶活性温度依赖性。本发明一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法制备的低温型尿嘧啶DNA糖苷酶来源于低温微生物，在20‑25度表现最高的酶活性，而在50度加热5分钟即完全失活，显著改善了PCR的交叉污染防治效果。

主权项

1.一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一、设计合成嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒；重组嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化；步骤二，重组表达嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶；将嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；将表达菌株培养至OD600=0.6，加入0.5mM 诱导剂IPTG，在20℃温度下培养12小时，诱导嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶表达；嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如SEQ IDNO:1所示；SEQ IDNO:11 MKENPLDLLV SEIKKCTLCQ QYLPLGPHPV LQISRHAKII IAGQAPGVKV HNTGIPFDDA61 SGDRLRQWMG ITKATFYDAQ KIAILPMGFC YPGIGKSGDL PPRSECALAW RKQLLSAISD121 IKLILVIGAY AQNWHMKETK QKNLTETVRN WENYGPQLLP LPHPSPRNNI WLSKNPWFEQ181 DLLPQLKNRV KELL第三步，嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶亲和纯化；将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液；超声波破碎菌体，离心收集含有嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶的菌体裂解上清液；利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶；第四步，检测嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶活性温度依赖性；利用含dU的单链DNA作为底物，加入嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶，测定酶活性与温度依赖性。