[发明专利]一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：1）设计合成嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒；2）重组表达嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶；3）嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶亲和纯化；4）检测嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶活性温度依赖性。本发明一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法制备的低温型尿嘧啶DNA糖苷酶来源于低温微生物，在20‑25度表现最高的酶活性，而在50度加热5分钟即完全失活，显著改善了PCR的交叉污染防治效果。

技术领域

本发明涉及一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法。

背景技术

目前PCR交叉污染防治中添加的尿嘧啶DNA糖苷酶来源于常温微生物，其在低温下的失活效果不明显，只能在高温加热才能失活，导致PCR过程中目的基因扩增产量低，使得基于PCR的核酸检测灵敏度降低。

目前PCR中添加的尿嘧啶DNA糖苷酶来源于常温微生物，其只能在30-40度具有最高活性，同时只有在70度以上才失活。

发明内容

本发明针对现有PCR检测中添加的尿嘧啶DNA糖苷酶的缺陷，开发了一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，该方法制备出了在低温发挥活性的尿嘧啶DNA糖苷酶，该尿嘧啶DNA糖苷酶来自于嗜冷微生物Colwellia psychrerythraea，并经过基因改造，使得其在20-25度的温度范围内，能够有效发挥最高活性，而在高温迅速丧失活性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是设计一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、设计合成嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒；重组嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化；

步骤二，重组表达嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶；将嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；将表达菌株培养至OD600=0.6，加入0.5mM 诱导剂IPTG，在20℃温度下培养12小时，诱导嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶表达；

嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如SEQ IDNO:1所示。

SEQ IDNO:1

1 MKENPLDLLV SEIKKCTLCQ QYLPLGPHPV LQISRHAKII IAGQAPGVKV HNTGIPFDDA

61 SGDRLRQWMG ITKATFYDAQ KIAILPMGFC YPGIGKSGDL PPRSECALAW RKQLLSAISD

121 IKLILVIGAY AQNWHMKETK QKNLTETVRN WENYGPQLLP LPHPSPRNNI WLSKNPWFEQ

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