[发明专利]NGN2介导成年鼠嗅鞘细胞直接重编程为神经元的方法及其应用

摘要

本发明涉及细胞重编程领域，具体是NGN2介导成年鼠嗅鞘细胞直接重编程为功能性神经元的方法，并将重编程所得神经元用于移植治疗脊髓损伤。本发明首次发现单独应用Neurogenin 2(NGN2)这一个转录因子在两周时间内即可将OECs重编程为神经元。该技术体系的建立，将会对移植自体细胞诱导所得神经元治疗脊髓损伤提供有力技术支持。

主权项

1.NGN2介导成年鼠嗅鞘细胞直接重编程为功能性神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、成年小鼠OECs原代培养成年小鼠鼻中隔两侧的粘膜以及鼻甲表面粘膜放入4℃的解剖液中，在显微镜下剥离粘膜外边的薄膜，剪碎，或取成年小鼠嗅球的嗅神经层和嗅小球层部分剪碎；剪碎后，用0.25％的胰酶在37℃细胞培养箱中消化15min，加入DF12‑15％FBS培养基终止消化，离心机800rpm离心4min后吸去上清，重新加入适量培养液后反复吹打单细胞悬液，然后种到不涂胶的T25培养瓶中；36h后将悬浮的细胞液移到新的不涂胶的T25培养瓶中，再过36h后，将没有贴壁的细胞悬液种在涂有0.1mg/ml L‑型多聚赖氨酸的培养板上；随后在嗅鞘细胞的培养液中加入2uM的Forskolin和10ng/ml的bFGF；在细胞培养过程中每隔两天换一次液，一周左右即可传代，传代1～2次后用于细胞诱导；B、NGN2质粒构建和慢病毒包装利用PCR仪扩增含有NGN2的目的基因片段，反转录得到cDNA，将携带有人源性NGN2基因的cDNA片段构建到第三代慢病毒载体pCSC‑SP‑IRES‑GFP上，获得pCSC‑SP‑PW‑NGN2‑IRES‑GFP，简称为NGN2慢病毒质粒；病毒包装时，在DMEM中将NGN2慢病毒质粒与包装质粒pMDL，VSV‑G，和pREV按照4：1：1：1混合，通过瞬时转染HEK293T细胞的方法产生出携带有NGN2‑GFP基因的复制缺陷型慢病毒，在转染后第10‑15h换成培养HEK293T细胞的培液，之后在第24h收集一次病毒上清，在第48h收集第二次病毒上清，将两次收集的病毒液混合离心，经滤器过滤后可直接用于感染OECs；C、OECs重编程为神经元将OECs传代后种在铺有PLL及基质胶的细胞培养板上或者细胞玻片上，待细胞完全贴壁后培养2‑3天，将离心纯化后的慢病毒添加6μg/ml聚凝胺polybrene之后加入到培养孔板中感染OECs，10‑12h后换成OECs培养液，待细胞感染病毒约48h后换成神经元诱导培养基，在此诱导培养基中含有DMEM/DF12、Neurobasal溶液、0.8％N‑2、0.4％B27、Forskolin 2uM、BMP通路抑制剂Dorsomorphin 1μM、成纤维细胞生长因子10ng/ml及1％青链霉素，每隔一天更换一次培养基。