[发明专利]NGN2介导成年鼠嗅鞘细胞直接重编程为神经元的方法及其应用

说明书

本发明涉及细胞重编程领域，具体是NGN2介导成年鼠嗅鞘细胞直接重编程为功能性神经元的方法，并将重编程所得神经元用于移植治疗脊髓损伤。本发明首次发现单独应用Neurogenin 2(NGN2)这一个转录因子在两周时间内即可将OECs重编程为神经元。该技术体系的建立，将会对移植自体细胞诱导所得神经元治疗脊髓损伤提供有力技术支持。

技术领域

本发明涉及细胞重编程技术领域，具体地说，是利用成年小鼠的成体嗅鞘细胞直接重编程为功能性神经元的方法。

背景技术

细胞移植已经成为治疗脊髓损伤的一个重要手段。嗅鞘细胞(Olfactoryensheathing cells,OECs)移植技术经过多轮临床研究被证实是在是足够安全、可行的，它能够通过改善脊髓损伤局部微环境来发挥神经保护功能，进而有利于神经功能恢复，但效果还不够理想。脊髓损伤引起的主要病理变化是不可逆性局部神经元变性坏死和神经环路破坏，如何补充替代脊髓损伤局部变性丢失的神经元并重建局部神经环路是脊髓损伤治疗的关键。近年来，细胞重编程技术(Reprogramming technique)的出现给整个生命科学和再生医学带来了革命性的变化。通过细胞重编程，我们可以在体外将体细胞直接转分化为特定细胞类型。例如，成纤维细胞、星形胶质细胞或血管周细胞在体外通过直接重编程都可以不经历干细胞或前体细胞的状态而改变细胞的谱系，定向转分化成神经元。OECs是嗅觉系统内一类特殊的胶质细胞，同时存在于中枢(嗅球)和外周(鼻粘膜)神经系统，兼具星形胶质细胞和雪旺细胞的一些生物学特征。相对于成纤维细胞，OECs的细胞谱系与神经元比较接近，理论上较容易被重编程为神经元。更重要的是，OECs在临床上可以通过病人的鼻粘膜自身获取并进行体外扩增。另外，成纤维细胞重编程时，为转分化为神经元的细胞移植后不利于神经再生；而OECs重编程是，为被转分化为神经元的OECs移植后也可以发挥促进神经再生修复的作用。因此，OECs应该是一种理想的重编程靶细胞对象。目前，有关嗅鞘细胞重编程为神经元并应用于移植治疗脊髓损伤，尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供在体外建立将成年小鼠OECs重编程为功能性神经元的方法，并将重编程所得神经元用于移植治疗脊髓损伤。

本发明的第一方面，提供NGN2(Neurogenin 2)介导成年鼠嗅鞘细胞直接重编程为功能性神经元的方法，包括以下步骤：

A、成年小鼠OECs原代培养

成年小鼠鼻中隔两侧的粘膜以及鼻甲表面粘膜放入4℃的解剖液中，在显微镜下剥离粘膜外边的薄膜，剪碎，或取成年小鼠嗅球的嗅神经层和嗅小球层部分剪碎；剪碎后，用0.25％的胰酶在37℃细胞培养箱中消化15min，加入DF12-15％FBS培养基终止消化，离心机800rpm离心4min后吸去上清，重新加入适量培养液后反复吹打单细胞悬液，然后种到不涂胶的T25培养瓶中；36h后将悬浮的细胞液移到新的不涂胶的T25培养瓶中，再过36h后，将没有贴壁的细胞悬液种在涂有L-型多聚赖氨酸(PLL，0.1mg/ml)的培养板上；随后在嗅鞘细胞的培养液中加入2uM的Forskolin和10ng/ml的bFGF；在细胞培养过程中每隔两天换一次液，一周左右即可传代，传代1～2次后用于细胞诱导；

B、NGN2质粒构建和慢病毒包装

利用PCR仪扩增含有NGN2的目的基因片段，反转录得到cDNA，将携带有人源性NGN2基因的cDNA片段构建到第三代慢病毒载体(pCSC-SP-IRES-GFP)上，获得pCSC-SP-PW-NGN2-IRES-GFP(简称为NGN2)慢病毒质粒；病毒包装时，在DMEM中将NGN2慢病毒质粒与包装质粒(pMDL，VSV-G，和pREV)按照4:1:1:1，通过瞬时转染HEK293T细胞的方法产生出携带有NGN2-GFP基因的复制缺陷型慢病毒，在转染后第10-15h换成培养HEK293T细胞的培液，之后在第24h收集一次病毒上清，在第48h收集第二次病毒上清，将两次收集的病毒液混合离心，经滤器过滤后可直接用于感染OECs；