[发明专利]一种富含细胞因子的冻干粉制备方法

摘要

本发明公开一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，所述制备方法包括以下步骤：从人胎盘绒毛膜中分离间充质干细胞，用无血清间充质干细胞培养基体外培养扩增人胎盘绒毛膜间充质干细胞；收集P2到P4代的细胞培养液上清和P4代细胞裂解物上清；将两种上清混合后制备成含有干细胞细胞因子的冻干粉。本发明采用人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清液和细胞裂解物上清制备的冻干粉制备方法简单，能够保证间充质干细胞生长分泌的细胞因子的活性，提高细胞因子有效浓度，增加细胞因子种类，有效解决了细胞因子需低温保存的难题、细胞因子含量少的问题，为实现干细胞细胞因子在美容护肤品中的应用和产业化发展奠定了基础。

主权项

1.一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤（1），间充质干细胞分离与培养：无菌条件下分离新鲜胎盘绒毛膜间充质干细胞，用无血清间充质干细胞培养基培养扩增人胎盘绒毛膜间充质干细胞：新鲜人胎盘剥离绒毛膜，用生理盐水清洗去除血渍，置于含有1%双抗的生理盐水中浸泡10min，在置于注射用甲硝唑注射液中浸泡10min，最后再用生理盐水清洗一次，用灭菌的手术器材将胎盘绒毛膜组织剪碎，直径大小为1‑2mm；将组织块平铺于培养瓶中进行原代培养，待有足够传代的间充质干细胞长出后进行传代扩增；步骤（2），上清液收集：收集P2‑P4代之间人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清液和P4代细胞裂解物上清液：胎盘绒毛膜间充质干细胞培养至第二代后开始收集上清；当P2代细胞生长至80‑90%汇合度时进行培养上清收集，收集的培养上清置于‑80℃保存；细胞进行传代用DPBS清洗细胞1次，加重组胰酶将细胞消化为单细胞，DPBS清洗一次后按照1:4的传代比例传至细胞培养瓶中继续培养；当P3代细胞生长至80‑90%汇合度时，收集培养上清后再次传代，培养上清同样置于‑80℃保存；当P4代细胞生长至80‑90%汇合度时，收集培养上清，置于‑80℃保存，细胞用DPBS清洗细胞1次，加重组胰酶将细胞消化为单细胞，离心去除胰酶溶液，按照每5×105个细胞/ml的浓度加入生理盐水重悬细胞，置于‑80℃条件下2h后，取出并置于2‑4℃条件下解冻，完全融化后再次置于‑80℃条件下，如此反复冻融3次，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，置于‑80℃保存，收集的所有上清用于后续冻干粉的制备；步骤（3），冻干粉制备：将步骤（2）中收集的所有上清4℃解冻后，在无菌条件下混合收集的上清，并加入甘露醇作为冻干保护剂和赋形剂，加入甘露醇至其浓度达6%，待甘露醇完全溶解后置于4℃暂存，24h内置于冻干机中开始进行冻干制备；冻干程序如下：0℃，1h；0℃降至‑10℃，2h；‑10℃降至‑20℃,3h；‑20℃降至‑30℃,10h；‑30℃,1h，开始抽真空；‑30℃升至‑20℃,10h；‑20℃升至‑5℃,2h；‑5℃回温至25℃,3h；冻干结束后收集冻干粉，4℃保存。