[发明专利]一种富含细胞因子的冻干粉制备方法

说明书

本发明公开一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，所述制备方法包括以下步骤：从人胎盘绒毛膜中分离间充质干细胞，用无血清间充质干细胞培养基体外培养扩增人胎盘绒毛膜间充质干细胞；收集P2到P4代的细胞培养液上清和P4代细胞裂解物上清；将两种上清混合后制备成含有干细胞细胞因子的冻干粉。本发明采用人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清液和细胞裂解物上清制备的冻干粉制备方法简单，能够保证间充质干细胞生长分泌的细胞因子的活性，提高细胞因子有效浓度，增加细胞因子种类，有效解决了细胞因子需低温保存的难题、细胞因子含量少的问题，为实现干细胞细胞因子在美容护肤品中的应用和产业化发展奠定了基础。

技术领域

本发明涉及干细胞细胞因子，具体涉及一种人源间充质干细胞分泌的细胞因子制备成的冻干粉。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是一种来源于发育早期中胚层的多能干细胞，在体内和体外特定的诱导条件下，能够分化为脂肪、骨、软骨、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。间充质干细胞能够分泌大量的细胞因子，包括表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、生长分化因子11（GDF-11）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素6（IL-6）、前列腺素2（PGE2）、色氨酸代谢酶（IDO）、一氧化氮合酶（iNOS）。大量研究表明这些细胞因子能在一定程度上促进皮肤细胞生长、改善细胞生长微环境、促进伤口愈合、延缓衰老、改善皮肤生长状态等作用，因此间充质干细胞已被广泛应用于美容整形等领域，如去疤痕、填皱纹、增肤质、祛色斑、抗衰老和丰胸等，由于具有良好的美容效果和极小的副作用，间充质干细胞受到了人们的重视，是目前研究较多的一种干细胞美容技术。

传统的干细胞美容术包括静脉输注干细胞，或水光针注射干细胞，其价格昂贵，起效慢，而且会造成皮肤创伤，风险大。使用的间充质干细胞大多来源于骨髓、脐带血、脂肪，细胞数量少、活性较低。与其他来源的干细胞相比，人胎盘绒毛膜间充质干细胞具有低免疫原性、无致瘤性、增殖能力强、数量充足、细胞纯净、分泌细胞因子含量高等优点，能够在体外大量扩增，在干细胞美容的应用中具有独特的优势。若间充质干细胞来源于18-26周岁、健康、首次妊娠、剖腹产的女性胎盘绒毛膜，所使用的干细胞均为低代次干细胞，最大限度的保证了细胞质量。胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清和细胞裂解物上清中含有丰富的具有生物活性的细胞因子，但由于液态的培养上清在常温保存时间短，细胞因子失效快，严重阻碍了它的推广和应用。

发明内容

本发明提出了一种富含干细胞细胞因子的冻干粉制备方法，解决了现有技术中液态培养上清常温保存时间短、细胞因子含量不足和质量不佳的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种富含细胞因子的冻干粉制备方法，经过下列各步骤：

（1）间充质干细胞分离与培养：无菌条件下分离新鲜胎盘绒毛膜间充质干细胞，用无血清间充质干细胞培养基培养扩增人胎盘绒毛膜间充质干细胞；

（2）上清液收集：收集P2-P3代之间人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养上清液和P4代细胞裂解物上清液；

（3）冻干粉制备：将所收集的两种上清液混合，加入甘露醇作为保护剂和赋型剂，低温冷冻干燥制备成冻干粉。

作为本发明一种富含细胞因子的冻干粉制备方法的一种优选实施方式，步骤（1）干细胞分离与培养具体为：取新鲜人胎盘剥离绒毛膜，用生理盐水清洗去除血渍，置于含有1%双抗(青霉素和链霉素）的生理盐水中浸泡10min，在置于注射用甲硝唑注射液中浸泡10min，最后再用生理盐水清洗一次，用灭菌的手术器材将胎盘绒毛膜组织剪碎至大小为直径1-2mm；将组织块平铺于培养瓶中进行原代培养，待有足够传代的间充质干细胞长出后进行传代体外扩增。