[发明专利]一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用。从化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢中提取总RNA，逆转录获得第1链cDNA，并RT‑PCR扩增克隆获得Bm.DHR cDNA；以Bm.DHR cDNA为模板PCR扩增，酶切后将DNA片段连接载体获得pFLAG‑Bm.DHR，再PCR扩增获得反应模板，将反应模板进一步处理得到Bm.DHR siRNA；将Bm.DHR siRNA液过滤膜除菌，注射入每代均产滞育卵的一化性品种家蚕化蛹后2‑3天的雌蚕蛹腹部，化蛾后正常交配，产下非滞育卵。本发明让一化性品种家蚕产非滞育卵，对于研究家蚕胚胎滞育机制、进一步利用家蚕胚胎滞育进行传统养蚕业的技术革新与经济效益提高等，具有积极作用。

主权项

1.一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA，其特征在于：所述siRNA采用以下方法制备而成：1)解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得Bm.DHRcDNA(家蚕滞育激素受体cDNA)；3)以Bm.DHR cDNA为模板，通过PCR扩增得到Bm.DHR DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，将Bm.DHR DNA片段用HindIII/BamHI酶切，然后将酶切片段与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接获得pFLAG-Bm.DHR；4)以pFLAG-Bm.DHR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-Bm.DHR DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，得到纯化的大小为1311bp的目的DNA片段，作为反应模板；5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后再进行后续处理得到Bm.DHR siRNA，作为所述siRNA。