[发明专利]一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用。从化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢中提取总RNA，逆转录获得第1链cDNA，并RT‑PCR扩增克隆获得Bm.DHR cDNA；以Bm.DHR cDNA为模板PCR扩增，酶切后将DNA片段连接载体获得pFLAG‑Bm.DHR，再PCR扩增获得反应模板，将反应模板进一步处理得到Bm.DHR siRNA；将Bm.DHR siRNA液过滤膜除菌，注射入每代均产滞育卵的一化性品种家蚕化蛹后2‑3天的雌蚕蛹腹部，化蛾后正常交配，产下非滞育卵。本发明让一化性品种家蚕产非滞育卵，对于研究家蚕胚胎滞育机制、进一步利用家蚕胚胎滞育进行传统养蚕业的技术革新与经济效益提高等，具有积极作用。

技术领域

本发明涉及了一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用。

背景技术

滞育(Diapause)是昆虫在个体发育的某个特定阶段主动停止发育的一种现象，它作为一种遗传特性，在昆虫的生存、进化、繁荣等中发挥着重要的作用。家蚕(Bombyx mori)为卵滞育型，一化性(univoltine)品种蚕每代都产滞育卵。滞育卵需要经过长时间低温处理等才能解除其滞育，这给一年多次养蚕带来不便。所以对家蚕滞育现象的研究，一直为人们所关注。

蚕卵是否发生滞育，主要取决于蛹期由咽下神经节(Subpharyngeal ganglion，SG)合成和分泌的滞育激素(Diapause hormone，DH)作用。当合成和分泌的DH作用于卵巢和发育中蚕卵，引起多种基因表达上调，从而改变蚕卵内的物质代谢，成为滞育卵。家蚕DH的作用是通过家蚕滞育激素受体(Bm.DHR)来介导的，但有关Bm.DHR介导DH作用，来调控家蚕卵滞育等，均缺乏研究。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA、制备方法及应用，是采用RT-PCR克隆，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接，与T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合反应，再给雌蚕蛹腹部注射的方法，通过调控家蚕滞育激素作用，让一化性品种家蚕产非滞育卵。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明保护一种让一化性品种家蚕产非滞育卵的siRNA，所述siRNA采用以下方法制备而成：

1)解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；

2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得Bm.DHR cDNA(家蚕滞育激素受体cDNA)；

3)以Bm.DHR cDNA为模板，通过PCR扩增得到Bm.DHR DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，将Bm.DHR DNA片段用HindIII/BamHI酶切，然后将酶切片段与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3连接获得pFLAG-Bm.DHR；

4)以pFLAG-Bm.DHR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-Bm.DHR DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳回收，得到纯化的大小为1311bp的目的DNA片段，作为反应模板；

5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后再进行后续处理得到Bm.DHR siRNA，作为所述siRNA。

所述步骤1)具体为：解剖并收集化蛹第3天的雌蚕蛹卵巢，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录获得第1链cDNA，逆转录条件是：30℃变性10min，50℃反应60min，95℃灭活5min。

Trizol试剂盒来源于加拿大Bio Basic Inc公司；逆转录第1链cDNA合成试剂来源于美国Promega公司。