[发明专利]饲料中产气荚膜梭菌的微滴数字PCR检测方法在审
| 申请号： | 201711374188.6 | 申请日： | 2017-12-19 |
| 公开（公告）号： | CN108085376A | 公开（公告）日： | 2018-05-29 |
| 发明（设计）人： | 王准;曲辉;彭勃;罗雁非;王玮琳;李忠起;杨帆;刘金华;刘韬;李文君 | 申请（专利权）人： | 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 |
| 主分类号： | C12Q1/686 | 分类号： | C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/145 |
| 代理公司： | 长春市东师专利事务所 22202 | 代理人： | 张铁生 |
| 地址： | 130062 吉林*** | 国省代码： | 吉林;22 |
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| 摘要： | 本发明公开了鉴定产气荚膜梭菌的PCR扩增引物及探针引物，包括：产气荚膜梭菌引物正向序列：5＇‑CGCATAACGTTGAAAGATGG‑3＇，反向序列；5＇‑CCTTGGTAGGCCGTTACCC‑3＇；探针序列：5＇‑FAM‑TCATCATTCAACCAAAGGAGCAATCC‑TAMRA‑3＇；一种饲料中单增李斯特氏菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：称取样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液，进行增菌培养，得到增菌液；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；获得鉴定单增李斯特氏菌的PCR扩增引物及探针引物；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；对反应液进行检测与分析。结果表明该引物对单增李斯特氏菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增稳定，具有重复性；取浓度为108‑103的基因序列进行检测，灵敏度良好。 | ||
| 搜索关键词： | 数字PCR 微滴 单增李斯特氏菌 扩增 产气荚膜梭菌 检测 探针引物 引物正向序列 无菌培养液 待测样品 反向序列 基因序列 荚膜梭菌 探针序列 阳性对照 阴性对照 增菌培养 饲料 均质器 灵敏度 拍击式 增菌液 称取 袋中 均质 稀释 引物 匀液 拍打 分析 | ||
【主权项】：
1.饲料中产气荚膜梭菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：1）称取25g产气荚膜梭菌样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液；产气荚膜梭菌样品的增菌培养按照GB 4789.13进行；非目标菌株增菌采用LB培养液在36℃下培养20-30h；获得样品及对照组的增菌液；2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；3）获得鉴定产气荚膜梭菌的PCR扩增引物及探针引物；4）将步骤2）所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；所述的微滴数字PCR反应体系为20μL，各成分含量为：2×ddPCR 预混液10μL，上下游引物（10 µmol/L）各1μL，探针引物（10 µmol/L）1μL，模板DNA 4μL，双蒸水3μL；反应条件为：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物；体系完成后，进行数字PCR反应；5）对步骤4）的反应液进行检测与分析。
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