[发明专利]饲料中产气荚膜梭菌的微滴数字PCR检测方法

说明书

本发明公开了鉴定产气荚膜梭菌的PCR扩增引物及探针引物，包括：产气荚膜梭菌引物正向序列：5＇‑CGCATAACGTTGAAAGATGG‑3＇，反向序列；5＇‑CCTTGGTAGGCCGTTACCC‑3＇；探针序列：5＇‑FAM‑TCATCATTCAACCAAAGGAGCAATCC‑TAMRA‑3＇；一种饲料中单增李斯特氏菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：称取样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液，进行增菌培养，得到增菌液；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；获得鉴定单增李斯特氏菌的PCR扩增引物及探针引物；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；对反应液进行检测与分析。结果表明该引物对单增李斯特氏菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增稳定，具有重复性；取浓度为108‑103的基因序列进行检测，灵敏度良好。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及饲料中产气荚膜梭菌的微滴数字PCR检测方法。

背景技术

微滴数字PCR（ddPCR）是近年来发展起来的可以定量检测DNA的新方法，通过PCR扩增和荧光信号的积累读取阳性微滴数目。微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。该方法不需要核酸标准品，又兼具qPCR的优势。开发了高灵敏，高选择性的检测饲料中性致病菌的新方法。

产气荚膜梭菌（C.perfringens)是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌。产气夹膜梭菌是人类气性坏疽的主要病原菌。1892年，美国病理学家W.H.韦尔奇等自一尸体分出本菌，因而又称韦氏梭菌。菌体较大，大小为(0.9～1.3)×(3.0～9.0)微米，无鞭毛，有荚膜。芽孢椭圆形，位于次级端。厌氧不严格。菌落直径2～5毫米，血琼脂平板上有溶血圈。糖发酵能力强，产酸产气。本菌的特征之一是在牛乳培养基中呈暴烈发酵现象。形成的毒性物质有12种，可损伤细胞膜、血管内皮细胞并使糖类分解，导致细胞坏死、组织水肿、充气等病变。根据产生毒素种类和致病性的不同，本菌有A、B、C、D、E、F6个型。有些菌株产生肠毒素，可引起食物中毒。DNA中的G+C克分子含量为24～27%。本菌广泛存在于土壤、人和动物的肠道以及动物和人类的粪便中，会散发臭味。常因深部创伤而感染。导致气性坏疽的病原菌还有诺维氏梭菌、腐败梭菌、溶组织梭菌、产芽孢梭菌等。此外，产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡等的坏死性肠炎；诺维氏梭菌引起羊、牛的传染性坏疽性肝炎；腐败梭菌引起牛、羊、猪等家畜的肠型坏疽“快疫”(braxy)；肖维氏梭菌引起牛、羊气肿疽等。

因此建立一种溯源技术来排查饲料污染，控制饲料安全的关键环节具有重要意义。确定饲料中致病菌在食物链中相关的食品，寻找预防食品污染的关键环节，具备对突发事件的反应能力，建立和完善食源性致病菌及食源性疾病的监测系统和预警系统。微滴数字PCR技术可以弥补食源性病原菌上的应用的不足。

发明内容

本发明目的是为解决传统方法检测产气荚膜梭菌费时、复杂等问题，而提供一种方便、快速的饲料中产气荚膜梭菌的微滴数字PCR检测方法。

饲料中产气荚膜梭菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：