[发明专利]一种定量测定天麻中总天麻苷元含量的方法

摘要

本发明公开了一种定量测定天麻中总天麻苷元含量的方法，采用多份天麻样品分别在限定方法和环境下进行实验，最后根据实验结果作出标准曲线算法，得出规律性参数对应值，以测定天麻中天麻苷元含量。采用本发明的碱‑酶水解方法水解天麻中的各活性成分得到总天麻苷元，反应条件温和，经济环保；本发明采用高效液相色谱‑荧光检测的手段，与常用的高效液相‑紫外检测方法相比，灵敏度可由μg/mL提高到ng/mL，提高了1000倍；本发明采用总天麻苷元的含量作为天麻质量控制的评价标准，使质控成分更加明确、质量控制更加全面合理，为天麻的质量控制提供依据。

主权项

1.一种定量测定天麻中总天麻苷元含量的方法，包括如下步骤：1)提取：将各天麻样品编号并磨成粉末，选其中一份并从中称取0.5g样品，加于置有10mL 50％甲醇-水溶液的试管中，用玻璃棒将混合物搅拌混匀，进行超声处理并持续30min；然后再次用玻璃棒搅拌混匀，继续进行超声处理并持续30min；将所得混合物液体倒入10ml的EP管中，进行离心处理，保持3000rpm的速度处理10min，取离心处理后混合液的上清液，将所取上清液经0.22μm的微孔滤膜进行滤过处理，得滤液提取物；2)碱水解：取步骤1)中所得提取物50μL，与50μLNaOH溶液混合，所述NaOH溶液的浓度为0.5-3mol/L,该混合溶液制作3份，并将其分别于60-80℃环境温度进行水解0.5-2h，其后再用HCl溶液将每份混合溶液分别滴定至中性，所述HCl溶液浓度为0.5-3mol/L；3)酶水解：取步骤2)中碱水解后所得的3份样品，分别加入500μL 4mg/mL酶溶液，用缓冲液定容至1mL，将混合液进行水解处理，保持转速400-1000rpm并保持50℃环境温度持续震荡1-3h，将提取物中的总天麻素水解成天麻苷元；然后将离心处理所得水解后混合液放入85℃水浴锅放置4min进行灭活处理，冷却，每份样品加入3mL冰冷的纯甲醇，将即得混合液离心处理，4℃环境温度中保持转速12000rpm离心处理10min，经0.22μm的微孔滤膜进行滤过处理；从每份样品所得滤液中取400μL上清液,分别加入600μL50％甲醇-水溶液中混匀，分析测定得天麻提取物中总天麻苷元含量；4)高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)方法处理：对应样品分别进行处理，色谱柱为岛津InertSustain C18，色谱柱的长度、内径、粒径分别为150mm、4.6mm、5μm，柱温为30℃，流动相为纯甲醇和0.5％的甲酸水溶液，梯度洗脱程序：保留时间间隔段0-5min，0.5％的甲酸水溶液体积比5％-40％，即在参数段甲酸水溶液体积比由5％渐升至40％；保留时间间隔段5-15min，维持体积比40％的0.5％的甲酸水溶液；过程流速保持为1mL/min；荧光激发波长为275nm,发射波长为295nm；程序进样量为2μL；5)分析：以HPLC-FLD为手段对待测供试品溶液成分进行定性和定量分析：通过对一系列不同质量浓度的天麻苷元对照标准品溶液进行分析，获得对照标准品溶液中天麻苷元的保留时间和峰面积，通过对待测供试品溶液的分析，获得待测天麻提取物碱-酶水解后天麻苷元的保留时间和峰面积；6)实例测定：外标法测定天麻中总天麻苷元的含量；7)绘制图表：通过对一系列不同质量浓度的天麻苷元的对照标准品溶液进行分析，以天麻苷元的已知质量浓度和对应的峰面积作为横纵坐标，建立天麻苷元的标准曲线。将待测天麻提取物中总天麻苷元的峰面积代入标准曲线中，对其进行定量。