[发明专利]一种高通量富集和鉴定内源性N/O-连接糖肽的方法

摘要

本发明涉及一种基于体积排阻色谱和亲水作用色谱的内源性N‑/O‑连接糖肽的富集和检测方法，并用于肿瘤早期诊断。该发明包括以下四个步骤：1)去除高丰度蛋白质，利用高温变性和体积排阻效应，有效降低蛋白质非特异性吸附并去除干扰蛋白质；2)富集N‑/O‑连接糖肽，利用亲水作用色谱特异性富集N‑/O‑连接糖肽；3)质谱检测，优化质谱碎裂能量实现肽段骨架序列、糖链同时碎裂，基于‘去糖基化肽段索引’和‘理论去糖基化’策略实现糖肽结构解析；4)在此基础上，利用糖肽定量技术实现肿瘤患者与正常人血清中内源性肽段糖基化的精细差异分析，筛选潜在的疾病标志物。本方法实现了血清中内源性肽段糖基化的精细解析，对筛选肿瘤标志物具有重要的应用潜力。

主权项

1.一种高通量富集和鉴定内源性N/O‑连接糖肽的方法，其特征在于：(1)血清中高丰度蛋白质的去除：利用酸性条件下高温变性，降低蛋白质‑肽段的作用力；基于蛋白质、多肽的分子量差异，利用超滤膜的体积排阻色谱收集内源性肽段；(2)N‑/O‑连接糖基化肽段的富集：利用改进的亲水作用色谱制作成的Zip‑Tip小柱，先加入上样液离心去除非特异性吸附糖肽，再加入洗脱液洗脱糖基化修饰肽段，从而得到完整的内源性糖基化肽段，并取部分样品用PNGase F糖苷酶处理得到去N‑连接内源性糖肽，实现完整N‑/O‑连接内源性糖肽和去糖基化N‑连接糖肽的特异性富集；(3)N‑/O‑连接糖肽的质谱碎裂与谱图解析：结合Q‑Extractive高精度质谱搭配纳升级液相系统，采用数据依赖及靶向碎裂的质谱碎裂模式，利用糖基化肽段骨架和糖链能量碎裂的差异，选择基于台阶式的能量碎裂方式，实现N‑/O‑连接内源性糖肽的肽段骨架和糖链的同时碎裂，提高其鉴定效率；(4)N‑/O‑连接糖肽的谱图解析：结合Mascot蛋白序列搜索引擎，结合Uniprot数据库，实现N‑/O‑去糖基化肽段的骨架序列检索；利用Armone糖肽分析软件平台，基于去糖基化肽段索引的策略，进行完整糖基化肽段与去糖基化肽段的匹配，实现N‑/O‑接内源性完整糖基化肽段的解析。