[发明专利]一种高通量富集和鉴定内源性N/O-连接糖肽的方法

说明书

本发明涉及一种基于体积排阻色谱和亲水作用色谱的内源性N‑/O‑连接糖肽的富集和检测方法，并用于肿瘤早期诊断。该发明包括以下四个步骤：1)去除高丰度蛋白质，利用高温变性和体积排阻效应，有效降低蛋白质非特异性吸附并去除干扰蛋白质；2)富集N‑/O‑连接糖肽，利用亲水作用色谱特异性富集N‑/O‑连接糖肽；3)质谱检测，优化质谱碎裂能量实现肽段骨架序列、糖链同时碎裂，基于‘去糖基化肽段索引’和‘理论去糖基化’策略实现糖肽结构解析；4)在此基础上，利用糖肽定量技术实现肿瘤患者与正常人血清中内源性肽段糖基化的精细差异分析，筛选潜在的疾病标志物。本方法实现了血清中内源性肽段糖基化的精细解析，对筛选肿瘤标志物具有重要的应用潜力。

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向中糖基化蛋白质组学技术领域，具体涉及N-和O-连接内源性糖基化肽段的同时富集和鉴定新方法，以及该技术在肿瘤临床诊断中的应用。

背景技术

内源肽段是重要的生物组成和标志物，其结构和功能变化对许多疾病有重要的影响。内源肽的获得一般依靠于蛋白质变性，主要方法有分为物理方法和化学方法，物理方法包括高温、紫外线、x-射线、超声波、高压、剧烈搅拌、震荡等；化学方法有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐、三氯乙酸、浓乙醇等。本发明采用高温变性的方法，并加入TFA降低肽段-蛋白相互作用，降低内源性多肽样品的损失，结合超滤管的尺寸排阻效应，有效去除高丰度蛋白质的干扰，获得内源性肽段，操作简便、高效。

蛋白质糖基化作为一种最普遍且最重要的翻译后修饰，参与了细胞凋亡、免疫应答、细胞-细胞相互作用，配体-受体相互作用以及疾病的发生发展等生命过程。目前，临床上所用的疾病标志物大多是糖基化蛋白质，如肝癌的标志蛋白-甲胎蛋白(AFP)，恶性肿瘤的标志物-癌症抗原125(cancer antigen 125)，以及前列腺癌的标志物—前列腺癌特异抗原(PSA)等等。因此，对于糖基化的全面深入研究具有非常重要的意义。

在糖基化蛋白质组分析中，高效液相色谱-质谱联用是规模化分析糖蛋白/糖肽的一种有效平台。由于相对于非糖肽或非糖蛋白而言，糖肽或糖蛋白的含量很低，并且糖肽或糖蛋白的离子信号强度往往会被非糖肽或糖蛋白的离子信号所抑制。因而在进行蛋白质糖基化分析时，对糖肽/糖蛋白进行预分离和富集十分关键。

目前，糖肽/糖蛋白的富集方法主要有凝集素亲和色谱法、亲水作用色谱法、以及通过糖链与材料的功能基团共价链接的酰肼化学方法。亲水作用色谱富集的主要原理就是利用亲水材料表面的亲水基团与糖链上的大量羟基通过形成亲水作用而结合起来，从而达到分离富集糖肽或糖蛋白的效果。与另外两种富集方法相比，亲水作用富集糖肽或糖蛋白具有操作简便、不破坏糖型结构的优势，进而能够同时鉴定糖链和糖肽，更具有优势，更适合用于完整糖基化肽段的分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以简便、高效、高通量分析复杂生物样品中N-/O-连接内源性糖基化的分析方法，并将其用于肿瘤患者血清内源性肽的差异分析。

本发明提供的方法是基于高温变性降低内源性肽段的吸附，体积排阻去除大分子蛋白质等干扰，结合选择性的亲水作用色谱实现N-/O-连接内源性糖肽的同时富集和检测，进而实现血清中内源性肽段糖基化的精细分析。

本发明采用如下技术方案：

首先，取生物样品，高温变性并超滤得到内源性肽段，再用点击麦芽糖亲水材料进行富集，富集到的糖肽用肽糖苷酶PNGase F处理，最后对释放的N-/O-连接糖肽进行质谱分析，以得到样品中的N/O-连接糖基化位点，N/O-连接糖肽，及对应的糖蛋白信息。

具体包含以下步骤，

1)取生物样品，稀释5-12倍体积于1％TFA中，高温90-100℃水浴中5-10min，取出冷却至室温；

2)步骤1)结束后得到的样品，转移至5-30kDa超滤管，14000g离心20-30min，再用1％TFA洗两次，冻干；