[发明专利]一种人脐静脉血管内皮细胞的原代分离培养及鉴定方法

摘要

本发明主要是涉及生物技术领域细胞的分离、培养与鉴定方法，尤其涉及一种分离培养脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)的方法，内容如下：采用健康产妇新生儿脐带，在生物安全柜内，将预热的I型胶原酶灌注入脐静脉血管，并浸没在预热的生理盐水中消化，消化完成后将静脉血管漂洗，合并离心后弃上清，培养基重悬细胞沉淀即可开始培养，本发明操作简单，整个消化过程处于操作台内，消化温度略低于37℃，适当的增加了消化时间，对于较细小的血管组织不会造成过度消化，同时避免了环境和其它杂细胞的污染风险，所得到的内皮细胞形态、表面的免疫表型及成管特性均为典型的内皮细胞特征，而且剩余的脐带组织仍可用于脐带组织其它细胞的分离处理如脐带间充质干细胞的分离培养。

主权项

1.技术方案本发明主要是一种脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)的原代分离、培养与鉴定方法，包括了以下步骤：（1）取新生儿15‑20cm 长的脐带，剪去两端有钳夹痕及血肿的部分，用镊子排出静脉血管中的血，用一个50ml注射器吸入部分生理盐水，去掉针头，插入脐带静脉血管一端口处，冲洗脐带静脉血管，直至无血液流出；（2）脐带用止血钳封住一端脐静脉，用注射器从另一端灌入约5mL 0.1%Ⅰ型胶原酶使其充盈整个脐静脉，用脐带夹夹住两端端口；（3）放置在15cm培养皿中，加入37℃预热的生理盐水，覆盖整根脐带，消化35~45min，消化完毕打开脐带夹，将消化液流入事先准备好的离心管中，然后用生理盐水冲洗管腔至少3遍，流出液合并收集于离心管，400g，离心8min；（4）离完心后使用4ml 血管内皮细胞完全培养基重悬沉淀，接种于1个T25中，置于5% CO₂饱和度的37℃孵箱中静置培养，细胞培养12‑24h后进行全量换液以除去未贴壁的细胞及残余组织直至细胞生长汇合至80%以上，进行细胞传代；（5）细胞传代：倒掉培养基，用生理盐水清洗2 次，加入37℃预热的TrypLE消化细胞，在显微镜下观察，一旦大部分细胞变圆，即加入3 倍的生理盐水稀释反应；用移液管将细胞吹打下来，并转移到一个50ml无菌离心管中，400g，离心8min，倒掉上清，新鲜培养基重悬，按照1.1×10⁴/cm²接种传代，使用P3以前的细胞进行实验；（6）HUVEC的鉴定：1） 形态学观察：在换液传代之前均需进行倒置显微镜下观察细胞形态和状态，HUVEC贴壁单层生长，呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形；2)细胞表面免疫标记物检测：收集生长对数期的P3细胞，贴壁细胞洗涤2次，0.25%胰酶/EDTA消化后制成细胞悬液，过滤，密度为1 ×10⁶/ml，每份细胞悬液取150 μL×2分装2个试管，分别加入FITC‑KDR，FITC‑CD31，FITC‑vWF各10 μL，避光反应30 min，PBS洗涤2次测定，上机后收集10000个细胞，结果以各种抗原表达阳性百分率表示；3)成管能力的检测：96孔板每孔加入400μlMatrigel，37℃固化1h后，按5000/孔、 10000/孔、20000/孔的密度接种HUVEC （优选20000/孔），放置培养箱孵育3~6h后观察。