[发明专利]一种人脐静脉血管内皮细胞的原代分离培养及鉴定方法

权利要求书

1.技术方案本发明主要是一种脐静脉血管内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell，HUVEC)的原代分离、培养与鉴定方法，包括了以下步骤：

（1）取新生儿15-20cm 长的脐带，剪去两端有钳夹痕及血肿的部分，用镊子排出静脉血管中的血，用一个50ml注射器吸入部分生理盐水，去掉针头，插入脐带静脉血管一端口处，冲洗脐带静脉血管，直至无血液流出；

（2）脐带用止血钳封住一端脐静脉，用注射器从另一端灌入约5mL 0.1%Ⅰ型胶原酶使其充盈整个脐静脉，用脐带夹夹住两端端口；

（3）放置在15cm培养皿中，加入37℃预热的生理盐水，覆盖整根脐带，消化35~45min，消化完毕打开脐带夹，将消化液流入事先准备好的离心管中，然后用生理盐水冲洗管腔至少3遍，流出液合并收集于离心管，400g，离心8min；

（4）离完心后使用4ml 血管内皮细胞完全培养基重悬沉淀，接种于1个T25中，置于5%CO₂饱和度的37℃孵箱中静置培养，细胞培养12-24h后进行全量换液以除去未贴壁的细胞及残余组织直至细胞生长汇合至80%以上，进行细胞传代；

（5）细胞传代：倒掉培养基，用生理盐水清洗2 次，加入37℃预热的TrypLE消化细胞，在显微镜下观察，一旦大部分细胞变圆，即加入3 倍的生理盐水稀释反应；用移液管将细胞吹打下来，并转移到一个50ml无菌离心管中，400g，离心8min，倒掉上清，新鲜培养基重悬，按照1.1×10⁴/cm²接种传代，使用P3以前的细胞进行实验；

（6）HUVEC的鉴定：

1） 形态学观察：在换液传代之前均需进行倒置显微镜下观察细胞形态和状态，HUVEC贴壁单层生长，呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形；

2)细胞表面免疫标记物检测：收集生长对数期的P3细胞，贴壁细胞洗涤2次，0.25%胰酶/EDTA消化后制成细胞悬液，过滤，密度为1 ×10⁶/ml，每份细胞悬液取150 μL×2分装2个试管，分别加入FITC-KDR，FITC-CD31，FITC-vWF各10 μL，避光反应30 min，PBS洗涤2次测定，上机后收集10000个细胞，结果以各种抗原表达阳性百分率表示；

3)成管能力的检测：96孔板每孔加入400μlMatrigel，37℃固化1h后，按5000/孔、10000/孔、20000/孔的密度接种HUVEC （优选20000/孔），放置培养箱孵育3~6h后观察。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）血管内皮细胞完全培养基，该培养基是由DMEM/F12，低浓度胎牛血清(2%)，hEGF，皮质醇，庆大霉素和两性霉素B，hVEGF，hbFGF，R3 -IGF-1，抗坏血酸，以及肝素钠配制而成。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中Ⅰ型胶原酶浓度为0.1%；使用体积为0.4ml/cm长血管；消化时间为40min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）消化的操作过程在生物安全柜内进行，所需Ⅰ型胶原酶和生理盐水需提前预热至37℃。

5.根据权利要求4所述的方法，用注射器从脐带一端灌入Ⅰ型胶原酶使其充盈整个脐带，用脐带夹夹住两端端口，将脐带放置在15cm培养皿中，加入37℃预热的生理盐水，覆盖整根脐带。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5），使用胰酶消化获得HUVEC后，以1.1×10⁴/cm²的密度接种传代至175cm²内，放入37℃、5%CO₂、饱和湿度中进行培养。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中消化使用容器为15cm培养皿。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中脐带是24h内采集的。