[发明专利]一种肠道病毒分型检测试剂盒

摘要

本发明提供一种肠道病毒分型检测试剂盒，所述肠道病毒分型包括肠道病毒及其多个亚型：EV71、CVAl6、CVA6、CVA10、CVA2、CVA5、CVA4、CVA9、CVA12、Echo6、Echo9、Echo30、CVB2、CVB3、CVB4。本发明运用一步法多重实时荧光RT‑PCR，采用EV及其多个亚型病毒高度特异的引物和荧光标记探针，通过一个PCR八连管同时反应，标本中同时检测出是否有肠道病毒存在，并同时进行主要肠道病毒型别的分型鉴定。本方法比单重荧光PCR方法更便捷迅速、节约成本。病毒检测分型准确，可用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急快速筛查分型、供临床诊断及手足口病的流行病学的研究。

主权项

1.一种肠道病毒分型检测试剂盒， 所述肠道病毒分型包括肠道病毒及其多个亚型：EV71、CVAl6、CVA6、CVA10、CVA2、CVA5、CVA4、CVA9、CVA12、Echo6、Echo9、Echo30、CVB2、CVB3、CVB4，该试剂盒包含肠道病毒分型检测混合液、酶混合液、EV阳性对照品、阴性对照品、内标溶液，其特征在于，其中肠道病毒分型检测混合液装载于编码为①‑⑧的八连管内，其中八连管的每个管内含有PCR反应缓冲液和引物探针混合液，编号①‑⑧的八连管内有不同的引物探针混合液，分别为：①EV+Rnase P、②EV71+CVA16+CVA6、③CVA10+CVA2+CVA5、④CVA4+CVA9+CVA12、⑤Echo6+Echo9+Echo30、⑥CVB2+CVB3+CVB4、⑦EV+Rnase P、⑧EV+Rnase P，其中⑦用于检测阴性对照品，⑧用于检测EV阳性对照品；酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；引物探针混合液中各组上游引物和下游引物以及相应的不同荧光标记的探针序列如下：上游引物EV‑F： 5’‑CCCTGAATGCGGCTAATCC‑3’，下游引物EV‑R： 5’‑ATTGTCACCATAAGCAGCCA‑3’，特异性探针EV‑P： 5’‑ROX‑ AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC‑BHQ2‑3’，上游引物EV71‑F： 5’‑ GAGYATGATYGARACACGCTG‑3’，下游引物EV71‑R： 5’‑ CGCTCTRCTRAAGAARCTATC‑3’，特异性探针EV71‑P： 5’‑ FAM‑ AACTCGCACAGTACRGCTGARACCAC ‑BHQ1‑3’，上游引物CVA16‑F： 5’‑ CCCAATGGYGAGYTAGTCCCC‑3’，下游引物CVA16‑R： 5’‑ GTTGGTRGCWGTYTGCCAAGC‑3’，特异性探针CVA16‑P： 5’‑ HEX‑ AGTAYATGTATGTCCCRCCAGGGGCT‑BHQ1‑3’，上游引物CVA6‑F： 5’‑ AARCCRGATAGYAGGAAATC ‑3’，下游引物CVA6‑R： 5’‑ GGGGTGGATCACTCAATTTTG ‑3’，特异性探针CVA6‑P： 5’‑ROX‑ CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG–BHQ2‑3’，上游引物CVA10‑F： 5’‑ GAGACTGGACGYGTRCCA‑3’，下游引物CVA10‑R： 5’‑GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG‑3’，特异性探针CVA10‑P： 5’‑FAM‑CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC‑BHQ1‑3’，上游引物CVA2‑F： 5’‑ AGTCGRCCAGTGTCTCAYTCA‑3’下游引物CVA2‑R：5’‑TACACGCCCRGTCTCAATGG‑3’特异性探针CVA2‑P： 5’‑ HEX‑ AACAGCTGCWAACACCCAGGTRAGCC‑BHQ1‑3’上游引物CVA5‑F： 5’‑ AAGCGGCGGAGACAGGAG‑3’下游引物CVA5‑R： 5’‑ CCATGCCTGTTGACCACACA‑3’特异性探针CVA5‑P： 5’‑ROX‑ CAAAYGCCACCGAYGARAGCATGA‑BHQ2‑3’上游引物CVA4‑F： 5’‑ GGRTTYTCAAACTGGGATATTG‑3’下游引物CVA4‑R： 5’‑ CGCATRTATGTRAATGCYTCAAG‑3’特异性探针CVA4‑P： 5’‑FAM‑ CATTATGGCRTTTGTGCAAYTGCG‑BHQ1‑3’上游引物CVA9‑F： 5’‑ CCYAGYATYTTCTGGACRGA‑3’下游引物CVA9‑R：5’‑ GCTRTATGCATTYCCTATACTRATGA‑3’特异性探针CVA9‑P： 5’‑ HEX‑ AACGCACCAGCRCGCATGTCAATC‑BHQ1‑3’上游引物CVA12‑F： 5’‑ CGCCGYAAGCTAGAGATCTTCA‑3’下游引物CVA12‑R： 5’‑ GACTGGTDTTYCCRTTRCGCTC‑3’特异性探针CVA12‑P： 5’‑ROX‑ CATGCGCTTTGAYGCAGAGTTCACTT‑BHQ2‑3’上游引物Echo6‑F： 5’‑ TYAGRCAYGTGAATGACAAAACAA‑3’下游引物Echo6‑R： 5’‑ AYGCTTTCACGTGYTTTGGC‑3’特异性探针Echo6‑P： 5’‑FAM‑ AGYCCHATWACRAGCAAAGTKCGCA‑BHQ1‑3’上游引物Echo9‑F： 5’‑ CGYTTTGATGCRTGGGAGAT‑3’下游引物Echo9‑R： 5’‑ AAGCGCAAGTATGTRAACATCTC‑3’特异性探针Echo9‑P： 5’‑HEX‑ ACATGGTCCAAYTGCGCCGCA‑BHQ1‑3’上游引物Echo30‑F： 5’‑ CAGTGGCGTATTGAGCGATGTA‑3’下游引物Echo30‑R： 5’‑ ATCAACTACCACACCAGATCAGAGTC‑3’特异性探针Echo30‑P： 5’‑ROX‑ CACGCCGCTCTACCCATAAAGTTTTCTATTGA‑BHQ2‑3’上游引物CVB2‑F： 5’‑ GATCAGCATGTGTGTTTTACACGA‑3’下游引物CVB2‑R： 5’‑ GCCTGTCTAACACTCACCTTCCA‑3’特异性探针CVB2‑P： 5’‑FAM‑ TACACCAACAGCAAAAATGCAGCCAA‑BHQ1‑3’上游引物CVB3‑F： 5’‑ CCAGTAMCAGATAAAGTGGATTCRTA‑3’下游引物CVB3‑R：5’‑ AGGAARGGTATRGACATGCGTG‑3’特异性探针CVB3‑P： 5’‑HEX‑ CCAAGTGTGTTCTGGACAGAGGGTAATGC‑BHQ1‑3’上游引物CVB4‑F： 5’‑ CCGAACAAATCCCAGCCTTA‑3’下游引物CVB4‑R： 5’‑ CTGCATCGTGTCACTTGGGT‑3’特异性探针CVB4‑P： 5’‑ROX‑ CAGCCGTTGAAACTGGGCATACCTCTC‑BHQ2‑3’上游引物RNase P‑F： 5’‑ AGATTTGGACCTGCGAGCG‑3’下游引物RNase P‑R：5’‑ GAGCGGCTGTCTCCACAAGT‑3’特异性探针RNase P‑P： 5’‑ HEX ‑ TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG‑BHQ1‑3’；PCR反应缓冲液含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。