[发明专利]一种肠道病毒分型检测试剂盒

说明书

本发明提供一种肠道病毒分型检测试剂盒，所述肠道病毒分型包括肠道病毒及其多个亚型：EV71、CVAl6、CVA6、CVA10、CVA2、CVA5、CVA4、CVA9、CVA12、Echo6、Echo9、Echo30、CVB2、CVB3、CVB4。本发明运用一步法多重实时荧光RT‑PCR，采用EV及其多个亚型病毒高度特异的引物和荧光标记探针，通过一个PCR八连管同时反应，标本中同时检测出是否有肠道病毒存在，并同时进行主要肠道病毒型别的分型鉴定。本方法比单重荧光PCR方法更便捷迅速、节约成本。病毒检测分型准确，可用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急快速筛查分型、供临床诊断及手足口病的流行病学的研究。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及实时荧光RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一步法多重实时荧光RT-PCR在一个PCR八连管内检测患者标本中肠道病毒以及多个肠道病毒亚型的核酸检测方法，可应用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急诊断、肠道病毒快速筛查分型、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。

背景技术

肠道病毒(Enterovirus,EV)属于小RNA病毒科肠道病毒属。目前国际病毒分类委员会(ICTV)将其分为EV-A、EV-B、EV-C、EV-D、EV-E、EV-F、EV-G、EV-H、EV-J、RV-A、RV-B、RV-C共12个种www.picornaviridae.com(ICTV Master Species List 2015)，其中能够感染人的肠道病毒主要有EV-A(21型)、EV-B(59型)、EV-C(23型)、EV-D(4型)，型别高达百余种。

人类肠道病毒(human enterovirus,HEV)可导致多种疾病，如手足口病、脑炎、无菌性脑膜炎、急性弛缓性麻痹、呼吸系统疾病、肠胃炎等。手足口病(hand，foot and mouthdisease，HFMD)多发生于5岁以下儿童，以手、足、口、臀部出现皮疹症状为主要临床症状的常见传染病，主要以轻症为主，但重症及死亡病例也时有报道。以往关于手足口疫情的报道中，肠道病毒71型(EV-71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CV-A16)是引起手足口病病毒感染的最主要的病原体。但是，近几年肠道病毒的其他型别爆发和被报道的频率越来越高。2010年，芬兰手足口病疫情的主要病原体为CV-A6及CV-A10；2010年在日本与台湾地区，引起手足口病疫情的主要病原体为CV-A6；2014-2015年，法国手足口病疫情的主要病原体为CV-A6、CV-A10、CV-A16和EV-71。国内的调查研究显示，2013年，南京、上海、深圳等地区起手足口病疫情的主要病原为CV-A6和EV-71；2014年，北京地区的主要病原是CV-A16、EV-71、CV-A6和CV-A10；我们前期对2013-2014年杭州地区儿童手足口病的主要病原体调查发现，CV-A6取代EV-71成为杭州地区检出阳性率最高的的肠道病毒，EV-71位列第二。CV-A10检出率也高于CV-A16，列于主要病原的第三位。另外，其他的肠道病毒型别如CV-A2、CV-A4等在我国多个省份都有爆发和检出。2012年，云南省爆发的手足口疫情中，CV-B2与重症手足口病有关；2010-2012年，石家庄地区手足口疫情有CV-B3的流行。埃克病毒6型(Echoviruses 6，E-6)、E-9、E-30及CV-A5等肠道病毒型别也有相关报道。由此可见，引起手足口病的人类肠道病毒型别多，且病原谱容易发生时间和空间的变迁。

目前我国的肠道病毒分子诊断市场，仍然以检测肠道病毒通用型或肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型为主，导致手足口病病原体检测不明确或漏检等，造成患者治疗的延误及诊断试剂的浪费等。因而迫切需要开发一种能够检测肠道病毒并对主要的感染型别进行分型的检测试剂。