[发明专利]一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法

摘要

本发明公开一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法。将土壤样品预处理得第一悬混液；震荡破碎得破碎后的第一悬混液；超声，离心，收集第一上清液；用冷丙酮沉淀得到蛋白溶液；精密称取含蛋白质的蛋白溶液，加入单一蛋白酶或者蛋白酶组合，孵育过夜得多肽溶液；加入分离剂1涡旋，分离剂2涡旋，离心，静置，将约90％的含肽段的下层相转移到新的离心管中；再加入分离剂3，涡旋混匀后，离心，取下层；合并两次所得肽段溶液进行脱盐处理，收集洗出液；经离心浓缩干燥后，重新溶解肽段样品，直接上机分析。本发明所述方法操作简单、稳定性强、回收率高、提取全面而且通量高，对大量开展土壤蛋白质组学的相关研究具有重大的意义。

主权项

1.一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：/n(1)样品预处理：将土壤样品放入冷冻干燥机，干燥至衡重，低温破碎，过100目筛子，称取过筛后土壤样品，按质量比1:10加入裂解缓冲液；使其混匀，随后水浴80-95摄氏度加热处理30分钟-2小时，涡旋，得到第一悬混液；/n(2)震荡破碎：按照每0.5mL裂解缓冲液/2颗钢珠的比例将钢珠加入到步骤(1)中得到的第一悬混液，0～4℃下利用研磨机震荡破碎得到破碎后的第一悬混液；/n(3)超声提取：将步骤(2)中得到的破碎后的第一悬混液在冰上进行超声，进一步破碎，促使蛋白质充分溶出；离心，收集第一上清液；所述超声时控制超声破碎仪功率80～100w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5～10min；/n(4)冷丙酮沉淀：向步骤(3)中得到的第一上清液加入3-6倍体积的-20℃预冷的丙酮，在-20℃下静置5小时，高速离心，弃掉溶液，用-20℃的丙酮洗2次，然后加入50μL裂解缓冲液溶解蛋白质得到蛋白溶液；/n所述步骤(1)和(4)中的裂解缓冲液的配方为：70mM溴化四乙铵、0.5％二乙基二硫代氨基甲酸钠、10mM三(2-羧乙基)膦、30mM二氯乙酰胺、0.5％十二烷基硫酸钠，1M尿素，pH值调至8.0-8.2；/n(5)蛋白质酶解：精密称取步骤(4)所得含50μg蛋白质的蛋白溶液，加入单一蛋白酶或者蛋白酶组合，其中加入的蛋白质和每种蛋白酶质量比为20-50:1，于37℃孵育过夜得到多肽溶液；/n(6)肽段的提取和纯化：对于步骤(5)所得多肽溶液，加入分离剂1，涡旋5分钟，然后加入分离剂2，涡旋混匀，离心，静置10分钟，在不扰动沉淀和中间相的情况下，将90％的含肽段的下层相转移到新的离心管中；再加分离剂3，涡旋混匀后，离心，取下层；得到肽段溶液；所述分离剂1为二甲亚砜；其加入量与蛋白质的比例为：3-4μL：10μg；/n分离剂2为乙酸乙酯、环己烷和甲酸按照体积比5:1:0.01混合制备得到的混合液；其加入量与蛋白质的比例为：50-70μL：10μg；/n分离剂3配方为：乙酸乙酯和环己烷按照体积比6：1的比例混合制备得到的混合液，其加入量与蛋白质的比例为：50-70μL：10μg；/n(7)利用固相萃取离心柱对步骤(6)所得到的肽段溶液进行脱盐处理，收集洗出液；经离心浓缩干燥后，用复溶液充分涡旋重新溶解肽段样品，直接上机分析；所述复溶液配方为：含有2％体积的甲醇溶液，其中含有0.8％体积的甲酸；所述脱盐处理为：先用乙腈溶液润湿萃取柱，弃掉，重复一次；用0.2体积％甲酸平衡萃取柱，重复一次；将步骤(6)所得肽段溶液注入萃取柱；用0.1体积％甲酸的2体积％乙腈洗萃取柱，重复一次；用75％乙腈-0.1％甲酸洗脱萃取柱，洗二次，收集合并两次洗出液。/n