[发明专利]一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法

说明书

本发明公开一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法。将土壤样品预处理得第一悬混液；震荡破碎得破碎后的第一悬混液；超声，离心，收集第一上清液；用冷丙酮沉淀得到蛋白溶液；精密称取含蛋白质的蛋白溶液，加入单一蛋白酶或者蛋白酶组合，孵育过夜得多肽溶液；加入分离剂1涡旋，分离剂2涡旋，离心，静置，将约90％的含肽段的下层相转移到新的离心管中；再加入分离剂3，涡旋混匀后，离心，取下层；合并两次所得肽段溶液进行脱盐处理，收集洗出液；经离心浓缩干燥后，重新溶解肽段样品，直接上机分析。本发明所述方法操作简单、稳定性强、回收率高、提取全面而且通量高，对大量开展土壤蛋白质组学的相关研究具有重大的意义。

技术领域

本发明涉及到以蛋白组学分析为目的的全蛋白提取和处理方法，尤其是一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法。

背景技术

随着土壤宏基因组学的日益成熟和发展，作为后基因组时代重要技术平台的土壤宏蛋白质组学越来越受到关注。土壤蛋白质在碳氮磷的生物地球化学循环以及有机物的积累方面发挥重要作用，与土壤质量与可持续发展息息相关。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等。宏蛋白质组学是研究整个生态系统内所有微生物来源的蛋白质种类和丰度变化的技术手段。

在过去的10年中，宏蛋白质组学极大地加深了我们对于微生物群落以及它们所处的地球化学环境的理解。蛋白质组学的研究提供了不同微生物类群在凋落物分解过程中所起到的作用，对于胞外酶的研究可以揭示微生物量的限制因素、酶与凋落物分解的关系、酶活性与相关蛋白丰度的关系、酶的微生物起源以及落叶层生物与生物地球化学作用之间的关系。微生物蛋白与其生境的时间分布可以为微生物的多样性与其在生物地球化学作用过程中所扮演的角色的研究提供帮助。宏蛋白质组学将从一个新的水平上提供微生物演替和特定种群分布活动的信息，并且这些信息都能从表达的蛋白上得到解析。土壤微生物生物量巨大、种类繁多、不易分离培养，宏基因组学与蛋白质组学结合为解决这一难题提供了契机，特别是宏蛋白质组学可以深入地研究种群的多样性，可以直接观察蛋白质在环境样本中的变化，能够提供细胞的功能信息，可以细致地分析群落的结构与功能。宏蛋白质组学可以通过分析微生物酶的来源功能和活动来解决不同种类蛋白的混合表达问题，从而克服寻找酶信息与相关生态系统过程联系的困难。土壤宏蛋白质组学的研究是解析土壤宏基因功能的重要手段之一，对于碳氮磷的生物地球化学循环以及土壤有机质积累的研究具有重大价值，可将蛋白信息与相关的生态系统过程联系起来。

目前土壤宏蛋白组学研究面临的主要问题之一就是，蛋白组的提取难度大。主要有以下原因：1.土壤的基质非常复杂，对蛋白提取造成了干扰；2.蛋白质种类繁多，物理性质差异较大，目前使用的方法难以实现对所有蛋白质的高效提取；3.土壤蛋白丰度差异大，有些蛋白含量非常少，现有方法常常会漏提低丰度蛋白质；4.目前的处理方法总体而言过程都比较繁琐，期间容易造成污染和不确定因素；5.随着所需分析样本数量的增加，处理方法的通量也显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、稳定性强、回收率高、提取全面而且通量高的土壤宏蛋白组学研究样品的制备处理方法。

为实现上述目的，本发明提供一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：

(1)样品预处理：将土壤样品放入冷冻干燥机，干燥至衡重，低温破碎，过100目筛子，称取200-400mg过筛后土壤样品，优选的取300mg土壤样品，按质量比1:10加入裂解缓冲液；；使其混匀，随后水浴加热处理，涡旋，得到第一悬混液；

(2)震荡破碎：按照每0.5mL裂解缓冲液/2颗钢珠的比例将钢珠加入到步骤(1)中得到的第一悬混液，0～4℃下利用研磨机震荡破碎得到破碎后的第一悬混液；

(3)超声提取：将步骤(2)中得到的破碎后的第一悬混液在冰上进行超声，进一步破碎，促使蛋白质充分溶出；离心，收集第一上清液；