[发明专利]一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法

摘要

本发明公开了一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法，具体步骤如下抗原制备；抗体制备；多克隆抗体纯化；磁珠制备；磁性壳聚糖微球制备；多克隆抗体与氨基化修饰的磁性壳聚糖微球的偶联加入EDC·HCL溶液，戊二醛、兔抗单增李斯特菌多克隆抗体溶液，用的PBS溶液稀释至2ml，室温孵育5‑15min；在外加磁场下，去除上清，使用PBS溶液反复多次清洗，直至上清蛋白为0，弃上清；加入氨基化修饰的磁性壳聚糖微球2倍体积的5％BSA溶液，孵育，使偶联抗体的磁性壳聚糖微球封闭；在外加磁场作用下，弃上清，使用含0.05％Tween‑20的PBS溶液清洗偶联多克隆抗体的免疫磁珠多次，然后在室温下真空干燥上述免疫磁珠24h，即可。本发明具有高效、灵敏性好等优点。

主权项

一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：一、抗原制备：1.1、单增李斯特菌于LB平板上划线，37℃过夜培养；1.2、挑取李斯特菌落至10ml LB液体培养基中，摇菌；1.3、再按1％接种量扩大培养，37℃，180r/min的条件下，摇菌24h；1.4、加入体积浓度为40％的甲醛溶液，使甲醛溶液的最终体积浓度为0.3％，室温灭活24h；1.5、将菌液离心4‑8min，收集菌体，再加入PBS溶液重悬菌体，然后离心3‑6min，去上清，重复3次；1.6、使用200w超声波破碎仪破碎菌体，连续破碎30个循环，每循环5s，间隔9s；1.7、在12000r/min的条件下离心5‑15min，收集细胞碎片，无菌水重悬，制备得到抗原备用；二、抗体制备：2.1、取体重2.0kg健康纯种新西兰白兔，进行基础免疫，即取0.5ml上述抗原与弗氏完全佐剂1:1混匀，颈背部皮下多点注射，耳缘静脉每点注射0.1ml，3天后加强免疫，即取0.7ml抗原与弗氏不完全佐剂1:1混匀，颈背部每点注射0.1ml，耳缘静脉每点注射0.2ml，第5、7、9、11、13天采用和第3天一样的加强免疫；2.2、6天后，颈动脉取血，置于无菌试管中，待凝固后收集血清，制备得到抗体备用；三、多克隆抗体纯化：采用Protein A亲和层析柱法：先用5‑10倍柱体积的去离子水以25ml/min的速度洗出保护剂溶液，然后用平衡缓冲液平衡柱子，上样后继续用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，每管1ml，加入50μL中和缓冲液，冷冻干燥；四、磁珠制备：4.1、在通氮气的条件下，将12.1g FeSO4·7H2O、23.5g FeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在机械搅拌下快速把30ml氨水加入以上溶液中；4.2、1h后反应结束，在外加磁场作用下，弃上清；4.3、加入100ml乙醇，充分搅拌洗涤磁珠，在外加磁场下，收集磁珠，再用100ml蒸馏水洗涤，常温下真空干燥，即得Fe3O4纳米磁珠；五、磁性壳聚糖微球制备：5.1、称取10克壳聚糖加到200ml 2％乙酸溶液中浸泡过夜，使之溶解；5.2、取1gFe3O4纳米磁珠加入其中，室温下，300r/min条件下搅拌20min；5.3、然后加入200ml液体石蜡油，40℃下，300r/min条件下搅拌30min；5.4、温度升高至50℃，加入40ml甲醛，300r/min条件下，搅拌30min；5.5、向混合溶液中加入20ml 50％体积浓度的戊二醛，170r/min，60℃条件下搅拌，调节pH为10，搅拌4h；5.6、反应结束后向反应体系中加入100ml石油醚，充分搅拌，用布氏漏斗进行抽滤，获得磁性壳聚糖微球颗粒，然后再用乙醇充分搅拌洗涤，去除乙醇后再用蒸馏水洗涤，重复3‑5次乙醇和蒸馏水的洗涤操作，在50℃条件下真空干燥；六、磁性壳聚糖微球的表面氨基化修饰：6.1、称取1g磁性壳聚糖微球于三角瓶中，加入2ml环氧氯丙烷和0.5mol/L的NaOH溶液，60℃振荡反应12h，过滤除去液体；6.2、加入5ml的乙二胺和0.5mol/L的NaOH溶液，60℃振荡反应12h；6.3、产物经乙醇和蒸馏水依次洗涤，再在55℃下真空干燥24h，得到氨基化磁性壳聚糖微球；七、多克隆抗体与氨基化修饰的磁性壳聚糖微球的偶联：7.1、取0.01g的氨基化修饰的磁性壳聚糖微球于5ml离心管中，加入10mg/ml的EDC·HCL溶液，400μL戊二醛、40‑60μL 10mg/ml的兔抗单增李斯特菌多克隆抗体溶液，用0.01mol/LpH7.4的PBS溶液稀释至2ml，室温孵育5‑15min；7.2、在外加磁场下，去除上清，使用0.01mol/L pH7.4的PBS溶液反复多次清洗，直至上清蛋白为0，弃上清；7.3、加入氨基化修饰的磁性壳聚糖微球2倍体积的5％BSA溶液，37℃下，孵育0.5‑1.5小时，使偶联抗体的磁性壳聚糖微球封闭；7.4、在外加磁场作用下，弃上清，使用含0.05％Tween‑20的PBS溶液清洗偶联多克隆抗体的免疫磁珠多次，然后在室温下真空干燥上述免疫磁珠24h，即可。