[发明专利]一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米材料领域，具体来说是一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌简称单增李斯特菌，是李斯特菌属中最重要的人类食源性病原菌，可以感染人和多种动物，引起人和动物脑膜炎、败血症、流产等症状,该菌在自然界中分布广泛，并且在4℃冰箱保存的食物中仍能生长繁殖,是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一,极易污染肉、蛋、海产品、乳制品、蔬菜等食品，引起食物中毒和李斯特菌病的发生，尤其在欧美等发达国家经常发生，给人类健康和食品工业造成严重的危害。

然而目前对于致病菌的检测，一般需要较复杂的样本处理及长时间的预增菌，来达到方法的检测灵敏度,因此开发一种快速、灵敏、准且、简便的检测方法具有尤为重要的意义。

另一方面单一的免疫检测技术检测限往往较高，难以体现免疫检测技术的优势，已有研究者尝试将免疫检测技术与其他技术相结合或者两种免疫技术相结合来改进这一缺陷,目前已有免疫磁性微球富集技术与PCR技术相结合检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的报道,与单一PCR技术相比较，检测速度明显提高，但是仍然存在假阳性、污染、仪器昂贵等问题,因此为了提高免疫磁珠富集技术，需要从制备高质量的免疫磁性微球和高效的多克隆抗体方面入手，进行深入细致的探索与实践。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的检测速度慢、效果不好、质量差的缺陷，而提供一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法。

本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法，具体步骤如下：

一、抗原制备：

1.1、单增李斯特菌于LB平板上划线，37℃过夜培养；

1.2、挑取李斯特菌落至10ml LB液体培养基中，摇菌；

1.3、再按1％接种量扩大培养，37℃，180r/min的条件下，摇菌24h；

1.4、加入体积浓度为40％的甲醛溶液，使甲醛溶液的最终体积浓度为0.3％，室温灭活24h；

1.5、将菌液离心4-8min，收集菌体，再加入PBS溶液重悬菌体，然后离心3-6min，去上清，重复3次；

1.6、使用200w超声波破碎仪破碎菌体，连续破碎30个循环，每循环5s，间隔9s；

1.7、在12000r/min的条件下离心5-15min，收集细胞碎片，无菌水重悬，制备得到抗原备用；

二、抗体制备：

2.1、取体重2.0kg健康纯种新西兰白兔，进行基础免疫，即取0.5ml上述抗原与弗氏完全佐剂1:1混匀，颈背部皮下多点注射，耳缘静脉每点注射0.1ml，3天后加强免疫，即取0.7ml抗原与弗氏不完全佐剂1:1混匀，颈背部每点注射0.1ml，耳缘静脉每点注射0.2ml，第5、7、9、11、13天采用和第3天一样的加强免疫；

2.2、6天后，颈动脉取血，置于无菌试管中，待凝固后收集血清，制备得到抗体备用；

三、多克隆抗体纯化：

采用Protein A亲和层析柱法：先用5-10倍柱体积的去离子水以25ml/min的速度洗出保护剂溶液，然后用平衡缓冲液平衡柱子，上样后继续用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，每管1ml，加入50μL中和缓冲液，冷冻干燥；

四、磁珠制备：

4.1、在通氮气的条件下，将12.1g FeSO₄·7H₂O、23.5g FeCl₃·6H₂O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在机械搅拌下快速把30ml氨水加入以上溶液中；

4.2、1h后反应结束，在外加磁场作用下，弃上清；

4.3、加入100ml乙醇，充分搅拌洗涤磁珠，在外加磁场下，收集磁珠，再用100ml蒸馏水洗涤，常温下真空干燥，即得Fe₃O₄纳米磁珠；

五、磁性壳聚糖微球制备：

5.1、称取10克壳聚糖加到200ml 2％乙酸溶液中浸泡过夜，使之溶解；

5.2、取1gFe₃O₄纳米磁珠加入其中，室温下，300r/min条件下搅拌20min；

5.3、然后加入200ml液体石蜡油，40℃下，300r/min条件下搅拌30min；