[发明专利]一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清miRNA的方法

摘要

本发明公开了一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清miRNA的方法，通过特异性识别并切割未配对单链核酸和碱基错配双链核酸的能力，检查核酸探针与目标miRNA杂交中发生的错配和部分互补；然后利用结合到核酸探针上的辣根过氧化物酶与化学发光底物发生的酶促反应产生荧光，快速放大检测信号，根据荧光强度确定目标miRNA含量，其检测结果准确可靠，操作简便易行，具有成本低、高通量、无需进行核酸提取与扩增等优点。

主权项

一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清miRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：提取miRNA，使用Proteinase K消化血清中与miRNA结合的蛋白质，并通过Tween 20表面活性剂破坏细胞外囊泡的脂质双层膜，使血清中的miRNA游离出来；S2：提取核酸探针，将与目标miRNA互补配对的长段核酸探针分为两个部分，即两个短核苷酸链探针，分别为核酸探针1和核酸探针2；S3：在马来酸酐化96孔酶标板上通过酰胺反应连接一段DNA捕获序列，并加入处理后的血清样品、核酸探针1和核酸探针2，使两个短核苷酸链探针分别与目标miRNA序列中的一半互补配对；S4：通过核酸杂交将核酸探针1、血清中的目标miRNA及核酸探针2固定在酶标板上；S5：通过反复冲洗酶标板，去除错配和部分互补的miRNA，进一步提高其检测体系的特异性；S6：将S5中冲洗后的酶标板上的序列与Biotin标记的信号放大序列杂交，用SA‑HRP与信号放大序列上的Biotin标记结合，并加入化学发光底物溶液；S7：根据荧光强度确定血清中目标miRNA的表达量，从而检测出目标miRNA。