[发明专利]一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清miRNA的方法

说明书

本发明公开了一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清miRNA的方法，通过特异性识别并切割未配对单链核酸和碱基错配双链核酸的能力，检查核酸探针与目标miRNA杂交中发生的错配和部分互补；然后利用结合到核酸探针上的辣根过氧化物酶与化学发光底物发生的酶促反应产生荧光，快速放大检测信号，根据荧光强度确定目标miRNA含量，其检测结果准确可靠，操作简便易行，具有成本低、高通量、无需进行核酸提取与扩增等优点。

技术领域

本发明涉及癌症医疗诊断技术领域，具体为一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清miRNA的方法。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一类进化上保守内源性非蛋白质编码的RNA分子，长约20至24个核苷酸，能够识别特定的目标信使RNA(messagerRNA,mRNA)，并在转录后水平负调控基因。miRNA通过切割或抑制特定mRNA来负调控靶基因,广泛参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。如果miRNA以肿瘤抑制基因或者癌基因为靶向，miRNA的失常就能影响肿瘤形成。由于超过半数的miRNA基因位于肿瘤相关基因组区域或脆弱位点，异常表达的miRNA和多种肿瘤的发生，分期，转移和复发有着密切关系。

miR-21和miR-17-92家族被报道是与肿瘤关系最密切且具有癌基因功能的miRNA，在包括肺癌、淋巴瘤等多种肿瘤的发生及发展过程中表达增强。研究表明，miR-21通过调节基因PETN、PDCD4的抗凋亡活性，抑制肿瘤细胞的凋亡；将随着肿瘤恶性程度的增高，表达增强。同样，miR-17-92家族在肺癌中的高表达尤其是SCLC发展过程中起着十分重要的作用。miR-17-92家族在肺癌早期表达升高，但是随着肺癌的发展，其表达下降；并且通过抑制miR-17-92家族的表达可以抑制肺癌的发展并诱导其凋亡。目前，研究发现miRNA可作为一种新生物标志物，用于肿瘤的早期诊断和预后预测。但由于临床上缺乏成本低廉、操作简便的高通量miRNA检测技术。使得这一新标记物诊断方法目前仅存在于“实验室阶段”。

PCR技术是目前最常用miRNA检测技术，但是miRNA的长度仅约22个核苷酸，通常

在反转录时需要对miRNA加尾或者进行引物的延伸处理，得到一个较长的反转录扩增因子，为PCR提供合适的模板。但是，目标miRNA的超小尺寸导致要使用过短的寡核苷酸链引物，造成了解链温度(MeltingTemperature,Tm)的降低，影响了扩增的效率；其结果还可能会受miRNA前体(miRNAprecursor,pre-miRNA)的干扰。目前用于miRNA检测的PCR技术主要为stem-loop茎环法和PolyA加尾法，这两种方法在检测原理上存在差异。stem-loop茎环法是先设计一种具有特殊的茎环结构反转录引物，在反转录过程中完成模板链的延长；而PolyA加尾法是对目标miRNA采用多聚腺苷酸聚合酶在其末端加上一段PolyA尾，再采用常用的oligo(dT)反转录引物进行反转录，从而得到较长的模版链。这两种方法在检测特异性和检测通量上存在成本高、操作复杂等缺陷，阻碍了其临床应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清miRNA的方法，检测结果准确可靠，操作简便易行，具有成本低、高通量、无需进行核酸提取与扩增等优点，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于短核苷酸链连接检测癌症患者血清miRNA的方法，方法包括以下步骤：

S1：提取miRNA，使用ProteinaseK消化血清中与miRNA结合的蛋白质，并通过Tween20表面活性剂破坏细胞外囊泡的脂质双层膜，使血清中的miRNA游离出来；

S2：提取核酸探针，将与目标miRNA互补配对的长段核酸探针分为两个部分，即两个短核苷酸链探针，分别为核酸探针1和核酸探针2；