[发明专利]一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒

摘要

本发明公开了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，包括猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：将编码Cap蛋白的PCV2‑ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2‑ORF2 DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；和Cap重组蛋白包涵体变性步骤；和溶液置换及蛋白复性步骤：采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换与蛋白复性；和病毒样颗粒组装和回收步骤：使用中空纤维膜或膜包，以PBS对回收溶液进行超滤，浓缩；制备方法中蛋白复性效率高，可将包涵体持续、大量地制备得到病毒样颗粒，适合工业化生产。

主权项

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括，猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：将编码Cap蛋白的PCV2‑ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2‑ORF2 DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；Cap重组蛋白以包涵体形式存在细胞质中，破碎细胞取沉淀，然后对沉淀中的包涵体进行纯化；Cap重组蛋白包涵体变性步骤：在4℃的条件下，将包涵体溶解于Buffer‑S0中，4℃离心，取第一上清液；在0‑4℃的条件下，将第一上清液加至Buffer‑S1中，充分混合后有蛋白析出，4℃离心取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于Buffer‑S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后离心取第二上清液；测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer‑S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为20‑400μg/mL，得到变性蛋白溶液；溶液置换及蛋白复性步骤：在切向流超滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性；以Buffer‑RF作为置换液，超滤过程中，中空纤维膜或膜包的孔径为5‑8KD；超滤参数为：跨膜压TMP＝4.0‑7.0psi，膜通量1.572±0.756LMH，剪切力Shear＝3727‑3773S‑1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；病毒样颗粒组装和回收步骤：在2‑8℃条件下，将一次超滤溶液加至Buffer‑AS中，然后在2‑8℃条件下静置6‑18h，得到回收溶液；切向流超滤系统中，使用孔径为50KD的中空纤维膜或膜包，以PBS作为置换液对回收溶液进行超滤，浓缩；超滤参数为：跨膜压TMP＝8‑13psi，膜通量21.631±4.366LMH，剪切力Shear＝3019‑3098S‑1，收集二次超滤溶液，离心取沉淀，得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒。