[发明专利]一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒

说明书

本发明公开了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，包括猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：将编码Cap蛋白的PCV2‑ORF2基因全长DNA或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽碱基序列的PCV2‑ORF2 DNA片段插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；和Cap重组蛋白包涵体变性步骤；和溶液置换及蛋白复性步骤：采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换与蛋白复性；和病毒样颗粒组装和回收步骤：使用中空纤维膜或膜包，以PBS对回收溶液进行超滤，浓缩；制备方法中蛋白复性效率高，可将包涵体持续、大量地制备得到病毒样颗粒，适合工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法及通过该方法获得的病毒样颗粒，属于生物培养技术领域。

背景技术

在猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗制备过程中，由PCV2-ORF2基因编码的Cap蛋白具有折叠为PCV2病毒样颗粒(VLP)的潜力而被作为PCV2亚单位疫苗抗原。在利用原核表达系统进行PCV2 Cap蛋白重组表达过程中，工业化条件下过表达的PCV2 Cap重组蛋白(rPCV2 Cap)未与促溶蛋白进行融合表达，常常在细胞中堆积，形成不溶的形式的颗粒包涵体(Inclusion Body，IB)；由IB形态的rPCV2 Cap复性至蛋白天然构象或VLP具有较高的难度。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，蛋白复性效率高，以切向流超滤的方式，可将包涵体持续、大量地制备得到病毒样颗粒，适合工业化生产。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备方法，包括，

猪圆环病毒2型Cap重组蛋白包涵体的制备步骤：

将编码Cap蛋白的PCV2-ORF2基因全长DNA(序列如SEQ ID NO.1所示)或已去掉编码Cap蛋白N’端信号肽(41个氨基酸残基)碱基序列的PCV2-ORF2 DNA片段(序列如SEQ IDNO.2所示)插入原核表达载体中，转化大肠杆菌表达菌，诱导表达Cap重组蛋白；Cap重组蛋白以包涵体形式存在细胞质中，破碎细胞取沉淀，然后对沉淀中的包涵体进行纯化；

Cap重组蛋白包涵体变性步骤：

在4℃的条件下，将包涵体溶解于Buffer-S0中，4℃离心，取第一上清液；在0-4℃的条件下，将第一上清液加至Buffer-S1中，充分混合后有蛋白析出，4℃离心取蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶解于Buffer-S2中，4℃条件下震荡至少8h，然后离心取第二上清液；测定第二上清液中总蛋白浓度，添加Buffer-S2将第二上清液稀释至蛋白的浓度为20-400μg/mL，得到变性蛋白溶液；

溶液置换及蛋白复性步骤：

在切向流超滤系统中，采用恒体积透析法对变性蛋白溶液进行溶液置换及蛋白复性；以Buffer-RF作为置换液，超滤过程中，中空纤维膜或膜包的孔径为5-8KD；超滤参数为：跨膜压TMP＝4.0-7.0psi，膜通量1.572±0.756LMH，剪切力Shear＝3727-3773S^-1，收集含复性蛋白的一次超滤溶液；

病毒样颗粒组装和回收步骤：

在2-8℃条件下，将一次超滤溶液加至Buffer-AS中，然后在2-8℃条件下静置6-18h，得到回收溶液；切向流超滤系统中，使用孔径为50KD的中空纤维膜或膜包，以PBS作为置换液对回收溶液进行超滤，浓缩；超滤参数为：跨膜压TMP＝8-13psi，膜通量21.631±4.366LMH，剪切力Shear＝3019-3098S^-1，收集二次超滤溶液，离心取沉淀，得到猪圆环病毒2型病毒样颗粒。