[发明专利]一种C‑肽免疫抗原和抗C‑肽卵黄抗体及其制备与应用

摘要

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种C‑肽免疫抗原和抗C‑肽卵黄抗体及其制备与应用。本发明采用间接偶联法以C‑肽作为半抗原与载体蛋白多聚赖氨酸偶联制得C‑肽免疫抗原，然后用该抗原免疫母鸡，得到鸡蛋，采用PEG6000沉淀法提取抗C‑肽卵黄抗体，采用饱和硫酸铵溶液纯化抗C‑肽卵黄抗体，纯化效果好，得到的抗C‑肽卵黄抗体纯净，纯度可达到90％以上。同时，本发明制备出抗C‑肽卵黄抗体具有较强特异性；可用于C‑肽的快速免疫检测，具有良好的应用价值，可用于检测人体血清中的C‑肽，以此判断糖尿病分型。

主权项

一种C‑肽免疫抗原的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂的合成：将王树脂和赖氨酸混合进行偶联合成，得到8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂；(2)树脂裂解和去保护：将步骤(1)制得的8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂与裂解试剂混合，然后搅拌反应；反应后将反应液过滤，收集滤液，浓缩，浓缩物用水溶解并用乙醚萃取，得到七聚赖氨酸水溶液；(3)七聚赖氨酸的分离与纯化：采用高效反相液相色谱仪对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离，检测280nm吸收值，收集主峰析出液，浓缩，干燥，得到七聚赖氨酸；(4)将步骤(3)制得的七聚赖氨酸与MBS混合，搅拌反应，得到MBS活化的七聚赖氨酸；将C‑肽与MBS活化的七聚赖氨酸混合，搅拌反应，得到C‑肽免疫抗原粗品；(5)在‑15～‑20℃盐水浴，氮气保护下，将甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯依次滴加到Fmoc‑Cys‑OH中，反应5～10min；加入乙酸酐，在‑15～‑20℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1～1.5h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应15～30min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取，将Fmoc‑Cys‑OH以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍Fmoc‑Cys‑OH质量的硅胶，混匀，并干燥；(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的C‑肽免疫抗原粗品溶于PBS缓冲液，然后使用中压过柱，采用PBS缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4‑甲基‑3‑硝基苯胺反应，产物用PBS缓冲液洗涤；洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30～60min，得到C‑肽免疫抗原。