[发明专利]一种C‑肽免疫抗原和抗C‑肽卵黄抗体及其制备与应用在审

专利信息
申请号: 201710427909.9 申请日: 2017-06-08
公开(公告)号: CN107176997A 公开(公告)日: 2017-09-19
发明(设计)人: 卢业玉;吕瑞;赵肃清;夏娜娜;梁雨昕 申请(专利权)人: 广东工业大学
主分类号: C07K14/62 分类号: C07K14/62;C07K16/26;C07K16/02;G01N33/74
代理公司: 广东广信君达律师事务所44329 代理人: 杨晓松
地址: 510062 广东*** 国省代码: 广东;44
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 一种 免疫 抗原 卵黄 抗体 及其 制备 应用
【权利要求书】:

1.一种C-肽免疫抗原的制备方法,其特征在于包含如下步骤:

(1)8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂的合成:将王树脂和赖氨酸混合进行偶联合成,得到8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂;

(2)树脂裂解和去保护:将步骤(1)制得的8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂与裂解试剂混合,然后搅拌反应;反应后将反应液过滤,收集滤液,浓缩,浓缩物用水溶解并用乙醚萃取,得到七聚赖氨酸水溶液;

(3)七聚赖氨酸的分离与纯化:采用高效反相液相色谱仪对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离,检测280nm吸收值,收集主峰析出液,浓缩,干燥,得到七聚赖氨酸;

(4)将步骤(3)制得的七聚赖氨酸与MBS混合,搅拌反应,得到MBS活化的七聚赖氨酸;将C-肽与MBS活化的七聚赖氨酸混合,搅拌反应,得到C-肽免疫抗原粗品;

(5)在-15~-20℃盐水浴,氮气保护下,将甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯依次滴加到Fmoc-Cys-OH中,反应5~10min;加入乙酸酐,在-15~-20℃盐水浴,氮气保护下,继续反应1~1.5h,得到反应产物1;然后将反应产物1从盐水浴中取出,室温继续反应15~30min,得到反应产物2;在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取,得到乙酸乙酯相;在乙酸乙酯相中加入质量分数为10%的碳酸氢钠溶液进行萃取,将Fmoc-Cys-OH以及乙酸酐洗出;在乙酸乙酯相中加入水进行萃取,将残留的碳酸氢钠洗出;加入无水硫酸钠,除去乙酸乙酯相中残留水分;除去无水硫酸钠,乙酸乙酯相浓缩,加入2倍Fmoc-Cys-OH质量的硅胶,混匀,并干燥;

(6)将步骤(5)制得的产物装柱,步骤(4)制得的C-肽免疫抗原粗品溶于PBS缓冲液,然后使用中压过柱,采用PBS缓冲液为洗脱剂,收集含目标峰的流份;将得到的流份与等体积的乙醚混合,收集沉淀物;沉淀物与4-甲基-3-硝基苯胺反应,产物用PBS缓冲液洗涤;洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30~60min,得到C-肽免疫抗原。

2.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法,其特征在于:

步骤(1)中所述的王树脂和赖基酸的摩尔比为1∶7。

3.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法,其特征在于:

步骤(5)中所述的Fmoc-Cys-OH、甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯的体积比为1:1:1。

4.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法,其特征在于:

步骤(5)中所述的乙酸酐的用量为100mg/100μL Fmoc-Cys-OH。

5.一种C-肽免疫抗原,其特征在于通过权利要求1~4任一项所述的制备方法制备得到。

6.一种抗C-肽卵黄抗体,其特征在于利用权利要求5所述的C-肽免疫抗原制备得到。

7.权利要求6所述的抗C-肽卵黄抗体的制备方法,其特征在于包含如下步骤:

采用权利要求5所述的C-肽免疫抗原免疫母鸡,收集免疫后的母鸡产下的鸡蛋,提取鸡蛋中的卵黄抗体,得到抗C-肽卵黄抗体粗品;然后提纯卵黄抗体粗品,干燥,得到抗C-肽卵黄抗体。

8.根据权利要求7所述的抗C-肽卵黄抗体的制备方法,其特征在于:

所述的提取的具体操作为:

将获得的免疫鸡蛋消毒后破壳去膜收集蛋黄,加入蛋黄3倍体积的含PEG6000 3.5~5%w/w的PBS缓冲液,混匀,调节pH为7~7.4,搅拌30~40min后,2~4℃静置12~15h;离心取上清液,过滤,得到滤液;滤液中缓慢加入PEG6000使PEG6000终浓度为10~12%w/w,调pH至7~7.4,搅拌30~40min;离心,弃上清得沉淀,即为卵黄抗体粗品。

9.根据权利要求7所述的抗C-肽卵黄抗体的制备方法,其特征在于:

所述的提纯的方法优选为硫酸铵两步法,具体操作为:

将卵黄抗体粗品用PBS缓冲液溶解后,离心,取上清液,慢慢滴入与上清液等体积的饱和硫酸铵溶液,然后2~4℃静置12~15h;离心,得到沉淀,沉淀用PBS缓冲液溶解,再加入PBS缓冲液的1/2体积的饱和硫酸铵溶液,2~4℃静置1~2h;离心,得到沉淀物,真空冷冻干燥,得到抗C-肽卵黄抗体。

10.权利要求6所述的抗C-肽卵黄抗体在制备C-肽快速免疫检测产品中的应用。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于广东工业大学,未经广东工业大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201710427909.9/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top