[发明专利]一种C‑肽免疫抗原和抗C‑肽卵黄抗体及其制备与应用

权利要求书

1.一种C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂的合成：将王树脂和赖氨酸混合进行偶联合成，得到8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂；

(2)树脂裂解和去保护：将步骤(1)制得的8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂与裂解试剂混合，然后搅拌反应；反应后将反应液过滤，收集滤液，浓缩，浓缩物用水溶解并用乙醚萃取，得到七聚赖氨酸水溶液；

(3)七聚赖氨酸的分离与纯化：采用高效反相液相色谱仪对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离，检测280nm吸收值，收集主峰析出液，浓缩，干燥，得到七聚赖氨酸；

(4)将步骤(3)制得的七聚赖氨酸与MBS混合，搅拌反应，得到MBS活化的七聚赖氨酸；将C-肽与MBS活化的七聚赖氨酸混合，搅拌反应，得到C-肽免疫抗原粗品；

(5)在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，将甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯依次滴加到Fmoc-Cys-OH中，反应5～10min；加入乙酸酐，在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1～1.5h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应15～30min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取，将Fmoc-Cys-OH以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍Fmoc-Cys-OH质量的硅胶，混匀，并干燥；

(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的C-肽免疫抗原粗品溶于PBS缓冲液，然后使用中压过柱，采用PBS缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4-甲基-3-硝基苯胺反应，产物用PBS缓冲液洗涤；洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30～60min，得到C-肽免疫抗原。

2.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的王树脂和赖基酸的摩尔比为1∶7。

3.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的Fmoc-Cys-OH、甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯的体积比为1:1:1。

4.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的乙酸酐的用量为100mg/100μL Fmoc-Cys-OH。

5.一种C-肽免疫抗原，其特征在于通过权利要求1～4任一项所述的制备方法制备得到。

6.一种抗C-肽卵黄抗体，其特征在于利用权利要求5所述的C-肽免疫抗原制备得到。

7.权利要求6所述的抗C-肽卵黄抗体的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

采用权利要求5所述的C-肽免疫抗原免疫母鸡，收集免疫后的母鸡产下的鸡蛋，提取鸡蛋中的卵黄抗体，得到抗C-肽卵黄抗体粗品；然后提纯卵黄抗体粗品，干燥，得到抗C-肽卵黄抗体。

8.根据权利要求7所述的抗C-肽卵黄抗体的制备方法，其特征在于：

所述的提取的具体操作为：

将获得的免疫鸡蛋消毒后破壳去膜收集蛋黄，加入蛋黄3倍体积的含PEG6000 3.5～5％w/w的PBS缓冲液，混匀，调节pH为7～7.4，搅拌30～40min后，2～4℃静置12～15h；离心取上清液，过滤，得到滤液；滤液中缓慢加入PEG6000使PEG6000终浓度为10～12％w/w，调pH至7～7.4，搅拌30～40min；离心，弃上清得沉淀，即为卵黄抗体粗品。

9.根据权利要求7所述的抗C-肽卵黄抗体的制备方法，其特征在于：

所述的提纯的方法优选为硫酸铵两步法，具体操作为：

将卵黄抗体粗品用PBS缓冲液溶解后，离心，取上清液，慢慢滴入与上清液等体积的饱和硫酸铵溶液，然后2～4℃静置12～15h；离心，得到沉淀，沉淀用PBS缓冲液溶解，再加入PBS缓冲液的1/2体积的饱和硫酸铵溶液，2～4℃静置1～2h；离心，得到沉淀物，真空冷冻干燥，得到抗C-肽卵黄抗体。

10.权利要求6所述的抗C-肽卵黄抗体在制备C-肽快速免疫检测产品中的应用。