[发明专利]一种C‑肽免疫抗原和抗C‑肽卵黄抗体及其制备与应用在审
申请号: | 201710427909.9 | 申请日: | 2017-06-08 |
公开(公告)号: | CN107176997A | 公开(公告)日: | 2017-09-19 |
发明(设计)人: | 卢业玉;吕瑞;赵肃清;夏娜娜;梁雨昕 | 申请(专利权)人: | 广东工业大学 |
主分类号: | C07K14/62 | 分类号: | C07K14/62;C07K16/26;C07K16/02;G01N33/74 |
代理公司: | 广东广信君达律师事务所44329 | 代理人: | 杨晓松 |
地址: | 510062 广东*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 免疫 抗原 卵黄 抗体 及其 制备 应用 | ||
1.一种C-肽免疫抗原的制备方法,其特征在于包含如下步骤:
(1)8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂的合成:将王树脂和赖氨酸混合进行偶联合成,得到8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂;
(2)树脂裂解和去保护:将步骤(1)制得的8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂与裂解试剂混合,然后搅拌反应;反应后将反应液过滤,收集滤液,浓缩,浓缩物用水溶解并用乙醚萃取,得到七聚赖氨酸水溶液;
(3)七聚赖氨酸的分离与纯化:采用高效反相液相色谱仪对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离,检测280nm吸收值,收集主峰析出液,浓缩,干燥,得到七聚赖氨酸;
(4)将步骤(3)制得的七聚赖氨酸与MBS混合,搅拌反应,得到MBS活化的七聚赖氨酸;将C-肽与MBS活化的七聚赖氨酸混合,搅拌反应,得到C-肽免疫抗原粗品;
(5)在-15~-20℃盐水浴,氮气保护下,将甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯依次滴加到Fmoc-Cys-OH中,反应5~10min;加入乙酸酐,在-15~-20℃盐水浴,氮气保护下,继续反应1~1.5h,得到反应产物1;然后将反应产物1从盐水浴中取出,室温继续反应15~30min,得到反应产物2;在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取,得到乙酸乙酯相;在乙酸乙酯相中加入质量分数为10%的碳酸氢钠溶液进行萃取,将Fmoc-Cys-OH以及乙酸酐洗出;在乙酸乙酯相中加入水进行萃取,将残留的碳酸氢钠洗出;加入无水硫酸钠,除去乙酸乙酯相中残留水分;除去无水硫酸钠,乙酸乙酯相浓缩,加入2倍Fmoc-Cys-OH质量的硅胶,混匀,并干燥;
(6)将步骤(5)制得的产物装柱,步骤(4)制得的C-肽免疫抗原粗品溶于PBS缓冲液,然后使用中压过柱,采用PBS缓冲液为洗脱剂,收集含目标峰的流份;将得到的流份与等体积的乙醚混合,收集沉淀物;沉淀物与4-甲基-3-硝基苯胺反应,产物用PBS缓冲液洗涤;洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30~60min,得到C-肽免疫抗原。
2.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的王树脂和赖基酸的摩尔比为1∶7。
3.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法,其特征在于:
步骤(5)中所述的Fmoc-Cys-OH、甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯的体积比为1:1:1。
4.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法,其特征在于:
步骤(5)中所述的乙酸酐的用量为100mg/100μL Fmoc-Cys-OH。
5.一种C-肽免疫抗原,其特征在于通过权利要求1~4任一项所述的制备方法制备得到。
6.一种抗C-肽卵黄抗体,其特征在于利用权利要求5所述的C-肽免疫抗原制备得到。
7.权利要求6所述的抗C-肽卵黄抗体的制备方法,其特征在于包含如下步骤:
采用权利要求5所述的C-肽免疫抗原免疫母鸡,收集免疫后的母鸡产下的鸡蛋,提取鸡蛋中的卵黄抗体,得到抗C-肽卵黄抗体粗品;然后提纯卵黄抗体粗品,干燥,得到抗C-肽卵黄抗体。
8.根据权利要求7所述的抗C-肽卵黄抗体的制备方法,其特征在于:
所述的提取的具体操作为:
将获得的免疫鸡蛋消毒后破壳去膜收集蛋黄,加入蛋黄3倍体积的含PEG6000 3.5~5%w/w的PBS缓冲液,混匀,调节pH为7~7.4,搅拌30~40min后,2~4℃静置12~15h;离心取上清液,过滤,得到滤液;滤液中缓慢加入PEG6000使PEG6000终浓度为10~12%w/w,调pH至7~7.4,搅拌30~40min;离心,弃上清得沉淀,即为卵黄抗体粗品。
9.根据权利要求7所述的抗C-肽卵黄抗体的制备方法,其特征在于:
所述的提纯的方法优选为硫酸铵两步法,具体操作为:
将卵黄抗体粗品用PBS缓冲液溶解后,离心,取上清液,慢慢滴入与上清液等体积的饱和硫酸铵溶液,然后2~4℃静置12~15h;离心,得到沉淀,沉淀用PBS缓冲液溶解,再加入PBS缓冲液的1/2体积的饱和硫酸铵溶液,2~4℃静置1~2h;离心,得到沉淀物,真空冷冻干燥,得到抗C-肽卵黄抗体。
10.权利要求6所述的抗C-肽卵黄抗体在制备C-肽快速免疫检测产品中的应用。
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